佛司可林类化合物对离体豚鼠气管条舒张作用的研究

汪亚勤，曹水娟，殷嘉珺，黄建明，翁鸿博

(复旦大学药学院，上海 201203)

毛喉鞘蕊花Coleμs forskohlii(Willd)Briq.系唇形科 Labiatae鞘蕊花属Coleμs Loμr.植物，产于印度和我国云南省等地，主要用于治疗感冒、咳喘等疾病。上世纪70年代，印度学者 Bhat等［1－2］从印度产毛喉鞘蕊花中分离到具有明显降压和强心作用的半日花烷型二萜，并由此引起人们对它的关注。国外研究主要集中于印度产品种中的有效成分佛司可林(forskolin)，其具有强大的腺苷酸环化酶激活作用，在临床上用于治疗心血管疾病、青光眼、支气管哮喘等［3－6］。国产品种中尚未分离得到佛司可林，但分离得到了与之结构类似的异佛司可林，据报道具有平喘解痉，抑制血小板凝聚等作用［7－8］，从国产品种中已经分离得到与印度产品种中相同的二萜和一些新的二萜类化合物，但相关的药理活性研究较少［9－11］。

在前期工作中，我们采用大孔树脂等提取纯化技术，获得了毛喉鞘蕊花提取物，并进行了化学成分研究［12］。本文主要研究从国产毛喉鞘蕊花提取物中分离得到的5种半日花烷型二萜类化合物即异佛司可林、佛司可林G、J、A、I以及国外产毛喉鞘蕊花中主要有效成分佛司可林对His、ACh诱导的豚鼠离体气管平滑肌标本收缩的影响，比较其舒张气管平滑肌的作用，为国产毛喉鞘蕊花的进一步研究与开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 豚鼠，♀♂不限，体质量250－350 g(上海西普尔－必凯实验动物有限公司提供)。

1.1.2 试剂 磷酸组胺(上海晶天生物科技有限公司);氯化乙酰胆碱(上海晶天生物科技有限公司);氨茶碱(上海信谊金朱药业有限公司);佛司可林(纯度大于98%，华诚生物科技有限公司);异佛司可林、佛司可林G、佛司可林J、佛司可林A、佛司可林I从国产毛喉鞘蕊花中分离得到，经MS、1HNMR、13C-NMR确定结构，采用HPLC-ELSD法测得其纯度大于98%。其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器 Hu-1型肌肉张力换能器(淮北正华生物仪器设备有限公司);MD3000型生物信号采集处理系统(淮北正华生物仪器设备有限公司);超级恒温槽(上海衡平仪器仪表厂);离体器官恒温肌槽(定制)。

1.2 方法

1.2.1 样品溶液的配制 取异佛司可林、佛司可林、佛司可林G以PEG400溶解至所需浓度，备用。佛司可林A，佛司可林 I ，先以100 μl二氯甲烷溶解，佛司可林J先以100 μl丙酮溶解，再用PEG400配成所需浓度，置60℃水浴中2 h，使有机溶剂完全挥发，备用。

1.2.2 豚鼠离体气管平滑肌实验 取豚鼠，♀♂不拘，头击处死。切开颈部皮肤及肌肉，取出气管置于通有95%O2+5%CO2混合气的 K reb’s营养液(NaCl 6.9 g、KCl 0.35 g、MgSO4·7H2O 0.29 g、KH2PO40.16 g、NaHCO32.1 g、CaCl20.28 g、Glucose 2 g、加蒸馏水至1 000 ml)中，去除气管周围结缔组织后将气管剪成宽约3～5 mm、长约30 mm的螺旋条。置于含30 ml Kreb’s营养液的离体器官恒温肌槽(37℃)中，通95%O2+5%CO2混合气，下端固定于离体器官恒温肌槽底部，上端连接于张力换能器，调节负荷为2 g，用MD3000型生物信号采集处理系统记录张力的变化，每30 min换液1次，稳定1 h［13］。

1.2.3 对His诱导的收缩反应的影响 加入3.3 mmol·L－1组胺溶液，使其终浓度为 3 3 μmol·L－1，待组胺引起气管条最大收缩时，换液，洗气管条5次，换液，待基线平稳后，再次加入His溶液，记录标本张力值，待其达到收缩峰值后，采用累积剂量法加入样品溶液或空白对照溶液，或一次性加入阳性对照液 4 4 mmol·L－1氨茶碱，其终浓度为 4 4 μmol·L－1。观察记录药物作用3 min时气管条的张力值，计算解痉百分率［解痉百分率/%=(给药前张力值－给药后张力值)/给药前张力值×100%］。

1.2.4 对ACh诱导的收缩反应的影响 加入1.1 mmol·L－1氯化乙酰胆碱溶液，使其终浓度为11 μmol·L－1，待ACh引起气管条最大收缩时，换液，洗气管条5次，换液，待基线平稳后，再次加入ACh溶液，记录标本的张力值，待其达到收缩峰值后，采用累积剂量法加入样品溶液或空白对照溶液，或一次性加入阳性对照溶液44 mmol·L－1氨茶碱，其终浓度为44 μmol·L－1。观察记录药物作用3 min时气管条的张力值，计算解痉百分率。

2 结果

2.1 佛司可林和异佛司可林对离体豚鼠气管条的影响

2.1.1 对His诱导的收缩反应的影响 气管条在Kreb’s营养液中平衡后，加入His引起气管条的收缩。空白组给药前后差异无统计学意义，各给药组均可明显舒张His所致的的豚鼠气管平滑肌的收缩，其中佛司可林在较低浓度(6.1、9.7 μmol·L－1)时舒张幅度不再增长，异佛司可林至更高浓度(9.7、24.4 μmol·L－1)时舒张幅度仍有增长趋势，EC50值分别为(4.1 ±1.2)、(7.8 ±2.7)μmol·L－1，见 Fig 1。

Fig 1 Effects of forskolin，isoforskolin on the contraction of isolated guinea pig trachea induced by His(±s，n=6)

2.1.2 对ACh诱导的收缩反应的影响 气管条在Kreb's营养液中平衡后，加入ACh引起气管条的收缩。空白组给药前后差异无统计学意义，各给药组均可明显舒张ACh所致的的豚鼠气管平滑肌的收缩，佛司可林与异佛司可林的舒张幅度随浓度增加而增大，且均在较高浓度(24.4 μmol·L－1)时，舒张幅度随浓度增加而仅有微小增大，最大舒张幅度佛司可林要大于异佛司可林，EC50值分别为(16.6±3.6)、(73.4 ±23.6)μmol·L－1，见 Fig 2。

2.2 佛司可林G、J、A、I对His诱导的离体豚鼠气管条收缩反应的影响 气管条在Kreb's营养液中平衡后，His引起了气管条的收缩。空白组给药前后差异无统计学意义，各给药组均可明显舒张His所致的的豚鼠气管平滑肌的收缩，其中佛司可林G、J、A、I舒张幅度随浓度增加而增大，最大舒张幅度从大到小依次为佛司可林 J、G、A、I，佛司可林 G、J、A、I的 EC50值分别为(18.8 ±4.5)、(7.1 ±6.2)、(24.3 ±12.1)、(64.7 ±9.5)μmol·L－1，见 Fig 3。

Fig 2 Effects of forskolin，isoforskolin on the contraction of isolated guinea pig trachea induced by ACh(±s，n=6)

Fig 3 Effects of forskolinG，J，A，I on the contraction of isolated guinea pig trachea induced by His(±s，n=6)

2.3 6 种佛司可林类化合物对His诱导的收缩反应影响的比较 绘制各化合物的量效关系曲线(Fig 4)，可观察到各给药组均可明显舒张His所致的豚鼠气管平滑肌的收缩，佛司可林、佛司可林J、异佛司可林、佛司可林G使气管平滑肌的舒张分别在浓度为 6.1、11.0、12.0、36.7 μmol·L－1时不再增长，而佛司可林A、佛司可林I在累积浓度为45.9 μmol·L－1时气管平滑肌的舒张仍呈增长的趋势。其舒张作用的排列(效价由大到小):佛司可林，佛司可林J，异佛司可林，佛司可林G，佛司可林A，佛司可林I。

3 讨论

气管平滑肌上主要分布有β2受体、M受体和H1受体。β2受体兴奋使支气管平滑肌舒张，M受体和H1受体兴奋使平滑肌收缩。His通过H1受体兴奋而发挥作用，H1受体兴奋可使支气管平滑肌收缩，His参与哮喘有关的反应大多由H1受体介导。ACh是M受体激动剂，它可以通过与G蛋白偶联，致磷脂酶C活化，产生1，4-肌醇三磷酸，诱发储存于内质网中Ca2+的释放，引起气道平滑肌收缩，产生支气管痉挛［14－15］。

本实验结果显示，佛司可林和异佛司可林对His、ACh刺激收缩下的离体气管螺旋条有明显的舒张作用，且随着浓度的加大而有所增长，推测两者均可能具有拮抗His、ACh的作用。比较其最大舒张幅度，在His组异佛司可林高于佛司可林，而在ACh组异佛司可林低于佛司可林;比较其解痉EC50，则异佛司可林均小于佛司可林。

佛司可林G、J、A、I这4个化合物对由His诱导引起的离体豚鼠气管条收缩也均有明显的舒张作用，亦随着浓度的增加而有所增加，推测均可能具有拮抗His的作用。与异佛司可林、佛司可林相比较，最大舒张幅度由大到小依次为佛司可林J、异佛司可林、佛司可林A、佛司可林、佛司可林G、佛司可林I，EC50从大到小依次为佛司可林、异佛司可林、佛司可林J、佛司可林 G、佛司可林I、佛司可林 A(Fig 4)。以上6个化合物的平喘作用机制，有待进一步研究。

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