内质网应激与脑缺血/再灌注损伤

武彩霞，刘 睿，杜冠华

(1.中国医学科学院药物研究所国家药物筛选中心北京 100050;2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院 沈阳 110016;3.山东医学高等专科学校临沂 276002)

脑缺血/再灌注损伤是在脑缺血基础上再灌注导致的脑组织进一步损伤，最终会导致神经细胞坏死或凋亡。凋亡的细胞主要为神经元，部分为神经胶质细胞和血管内皮细胞，其发生机制尚未完全清楚。关于细胞凋亡，内质网应激启动的凋亡途径，是除了死亡受体途径、线粒体途径外，目前较受关注的一种新的诱发凋亡途径［1］。有资料显示，缺血预适应(ischemic preconditioning，IPC)可以减轻缺血/再灌注造成的组织损伤，其机制与缺血预适应能减弱内质网应激密切相关［2，3］。另外，还有人认为，内质网应激在脑缺血/再灌注损伤的过程中，处于中心地位［4］。可见内质网应激是导致脑缺血/再灌注损伤的重要原因。本文对近年来内质网应激与脑缺血/再灌注损伤的关系进行综述，以期为脑卒中的理论及临床研究提供依据，并为治疗脑卒中的药物发现提供新思路。

1 内质网功能及内质网应激的机制

内质网和高尔基体是真核细胞内多数蛋白质合成、加工和转运的场所。蛋白质在内质网内完成转录、翻译过程，并经糖基化、折叠或装配成多亚基的聚合物，最终形成具有天然构象的蛋白质。然后由内质网运输到高尔基体，被进一步修饰，经高尔基体小泡运输到目的地。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是指缺血缺氧、葡萄糖或营养物质缺乏、脂质过度负荷、病毒感染、药物、毒素等有害因素破坏内质网的稳态，出现错误折叠与未折叠蛋白在腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱的状态。可分为3种类型［5］:(1)未折叠蛋白质反应(unfolded protein response，UPR);(2)内质网过度负荷反应(ER over-load response，EOR);(3)固醇调节元件结合蛋白质(sterol regulatory element binding protein，SREBP)通路调节反应。目前对UPR的研究比较深入，机制较为清楚，如果没有特殊说明，通常所说的ERS是指UPR［5］。

UPR是指内质网应激发生时，细胞自身通过减少蛋白质的合成，或增强内质网的蛋白折叠功能及内质网相关性蛋白降解途径(ER associated degradation，ERAD)的过程。UPR激活利于恢复细胞内环境的稳定，提高细胞在有害因素下的生存能力。但是当ERS非常剧烈或者持久时，细胞损伤过于严重，UPR不能使细胞内环境稳态及时恢复到正常，最终凋亡机制就会被触发，导致细胞死亡。

2 内质网应激的UPR信号转导与脑缺血/再灌注损伤

2.1 内质网应激的UPR信号转导途径 内质网应激诱导的UPR细胞信号转导通路主要包括3条:即PERK(protein kinase R—like ER kinase)通路、ATF6(activating transcription factor 6)通路、IRE1(inositol—requiring enzyme 1)通路。无应激状态下，PERK、ATF6、IRE1三种跨膜蛋白分别与内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78/免疫球蛋白结合蛋白(glucoseregulated protein 78/binding immunoglobulinprotein，GRP78/BiP)结合而处于失活状态。当 ERS发生时，GRP78与PERK、ATF6、IRE1解离，各跨膜蛋白自身结构域感应应激，拉响应激信号的警报，并将此信号传递给下游信号通道，对细胞进行保护。

2.1.1 IRE1/X盒蛋白l通路 IRE1是内质网I型跨膜蛋白，具有丝/苏蛋白激酶和位点特异的核酸内切酶活性。内质网中错误折叠蛋白的出现，使IRE1与GRP78分离，并形成同源二聚体，发生自身磷酸化被激活。IRE1激活后，能剪切XBP1mRNA中一个26bp长度的内含子，形成具有转录因子活性的 XBP1s蛋白［9］。XBP1s与已知的启动子元件结合，上调内质网应激的相关基因表达［6－7］

2.1.2 ATF6通路 ATF6是内质网Ⅱ型跨膜蛋白，有高尔基体定位信号能够感知应激［12］。ERS发生时，错误折叠蛋白或未折叠蛋白堆积促使GRP78和ATF6分离，ATF6转移至高尔基体。在高尔基体内，ATF6被特异蛋白酶位点l和特异蛋白酶位点2裂解，形成同源二聚体或与其他转录因子形成异源二聚体，激活XBP1和其他UPR靶向基因［8］

2.1.3 PERK信号通路 PERK是内质网的I型跨膜丝/苏蛋白激酶，属于真核细胞翻译起始复合物2α(eIF2α)激酶家族成员。ERS时，PERK与GRP78解离后形成同源二聚体，发生自身磷酸化被激活。PERK激活后，主要特异性磷酸化eIF2α，下调eIF2α活性水平，降低新生蛋白的翻译速率，下调细胞内蛋白质合成的整体水平，保护内质网的功能［9］。此外，PERK介导的eIF2α磷酸化还导致转录因子ATF4上调。ATF4进入胞核后激活C/EBP同源蛋白(C/EBP homology protein，CHOP)、生长抑制DNA损害诱导基因34、ATF3及关于氨基酸转运基因编码蛋白的表达，而且还抑制氧化应激。

2.2 脑缺血/再灌注损伤与内质网应激相关性死亡 脑缺血/再灌注时，细胞凋亡增加是脑组织损伤的重要原因。而缺血/再灌注及缺血缺氧性损伤是ERS发生的重要条件，细胞通过ERS自身产生应激性保护措施。但是剧烈或持久的ERS会诱导caspase-12、CHOP等表达，激活凋亡信号通路，诱导细胞凋亡，加重脑缺血/再灌注损伤。

2.2.1 脑缺血/再灌注损伤Ca2+浓度变化与内质网应激脑缺血是造成脑组织细胞内质网损伤的重要因素，尤其是在再灌注时。在缺血区，由于神经元缺少氧气和能量，导致细胞膜损伤及其功能障碍，引起跨膜离子浓度失衡，导致细胞外Ca2+内流增加;缺氧还会致使NO产生，这也促使内质网中Ca2+释放［10］;这些因素最终导致细胞内Ca2+超载。内质网腔内的Ca2+主要发挥两种作用:一是释入胞质作为第二信使;二是在内质网腔内调节蛋白酶活性。内质网大量Ca2+释入胞质会对细胞功能和状态产生严重而广泛的影响，如会破坏内质网与高尔基体之间以及胞核与胞质之间的膜转运等。另一方面，内质网依靠多种Ca2+依赖性蛋白酶的调节生成和加工分泌性蛋白质，因此Ca2+从内质网腔大量释出后，这些蛋白酶失去活性，导致蛋白质前体未经折叠、加工或错误折叠而在内质网腔内积聚，最终导致内质网应激发生。

2.2.2 脑缺血/再灌注损伤活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)产生与内质网应激 在能导致内质网应激的各种刺激中，活性氧是造成该细胞器严重损害的重要分子之一。内质网膜结构丰富，含有大量脂质，当产生ROS时很容易发生脂质过氧化反应，导致内质网功能严重障碍。脑缺血/再灌注过程中产生大量ROS，影响内质网膜上的钙离子泵功能，从而逐步耗竭内质网的Ca2+，引起细胞内游离Ca2+增加，诱发内质网应激和细胞凋亡［11］。此外，在脑缺血/再灌注过程中，缺血组织生成NO增多，导致过氧化亚硝酸盐也很容易在内质网产生。过氧化亚硝酸盐是一个毒性很高的分子，可能通过酪氨酸残基硝基化使各种蛋白功能受损。也有人认为，过多的NO可直接干扰内质网的功能，激活ERS。但是，NO激活ERS反应的机制还有待进一步的研究［10］。大量的研究表明内质网应激在缺血性神经细胞死亡中发挥积极作用。在A Young Cho研究中［12］，用thapsigargin和brefeldin A导致内质网应激诱导HT22鼠海马神经元细胞凋亡，发现thapsigargin和brefeldin A可使活性氧的产生和积聚是内质网应激的主要诱因。

2.2.3 脑缺血/再灌注损伤炎症发生与内质网应激 近来研究表明，脑缺血/再灌注后局部过度的炎症反应是引起再灌注损伤的主要原因之一。炎症反应可抑制神经元再生及其它与脑卒中后功能恢复相关的变化［13］。脑缺血/再灌注早期，血脑屏障破坏，通透性增加，引起白蛋白和其他大分子蛋白渗出，导致了水肿。此外，释放的超氧阴离子等和NO反应生成氧亚硝酸盐，触发炎症反应和细胞凋亡，引起进一步的组织损伤。缺血/再灌注后期，炎症基因激活，产生白介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor，TNFα)、干扰素调节因子(interferon regulatory factor，IRF)、NF-κB 等炎症介质，促进中性粒细胞贴壁和跨膜迁移，促进白细胞浸润，释放细胞因子和趋化因子，引起更广泛的脑组织固有细胞激活和血源性白细胞浸润，最终导致血脑屏障进一步受损，加重脑水肿，出现神经元迟发性死亡。可见脑缺血/再灌注可致炎症级联反应发生，进一步加重了脑组织损伤［14］。

研究表明，炎症和 ERS之间存在着广泛的联系［15－17］。有资料表明，LPS(Lipopolysaccharide)、IL-1β、IL-6、TNFα 等炎症因子均可引起ERS，但其机制目前还不清楚［18，19］。另外，ERS也会促进炎症发生。现已明确，NF-κB是重要的转录调控因子，在炎症反应发生过程中发挥主导作用。越来越多的资料表明［20－22］，某些药物对脑缺血/再灌注损伤的保护作用就是通过抗炎抗凋亡作用实现的，而这作用与抑制NF-κB的活化相关。ERS发生时，PERK-eIF2α介导的翻译减缓直接促进NF-κB激活［23］，由于 IκB的半衰期明显短于 NF-κB，PERK-eIF2α 介导的翻译抑制作用增加了 NF-κB/IκB 的比值，因此，游离的NF-κB转位到细胞核增多，促进炎症反应发生。此外，ERS发生时，IRE1α通路激活，IRE1α发生磷酸化，构象发生改变，与接头蛋白分子TNFα受体相关因子2(tumor necrosis factor-2，TRAF2)结合，形成 IRE1α-TRAF2 复合物。此复合物能够募集IκB激酶，使IκB磷酸化并降解，致NF-κB核转位增加，激活促炎症反应基因的转录。IRE1-TRAF2复合物还能够募集并活化蛋白激酶JNK，进而磷酸化和活化转录因子AP1，增加促炎症基因的表达。除了这两条通路外，ERS时ATF6通路也会促进NF-κB激活［19］。

另外，也有人认为［24－25］，在炎症早期阶段，ERS 促进NF-κB活化，产生炎症;在炎症后期，ERS可通过诱导NF-κB抑制因子A20的表达，抑制NF-κB的活性，抑制促炎因子的表达。根据这些研究结果，如何用药物干预脑缺血/再灌注过程炎症的早期阶段，减弱内质网应激，减少炎症损伤，发挥神经保护作用，值得深入研究。

2.3 内质网应激相关性死亡途径 内质网应激是应激条件下发生在细胞中的最初反应，蛋白质合成的暂停减轻了新生蛋白肽链对ER的负荷与压力，是细胞本身的一种自我保护性机制。但是，长时间的ERS会使未折叠蛋白持续增加，引起细胞功能失调，ERS由促细胞生存的保护效应向促细胞凋亡效应转化［26］。ERS引起的细胞凋亡有一套自身的信号传递通路，称为内质网相关性死亡(ERAD)途径。

2.3.1 Caspase-12的激活 Caspase-12定位于ER外膜，是ERS诱导凋亡的特异性蛋白酶，也是介导ERS凋亡的关键分子，能够单独通过内质网途径而不通过其他凋亡途径诱导细胞凋亡。非ERS时，caspase-12与蛋白分子伴侣BiP和caspase-7形成复合体，细胞不会表现凋亡;但是ERS时BiP减少，无法与 caspase-7、caspase-12充分结合，caspase-12激活［27］，从而进一步激活 caspase-9，caspase-9 把信息传递给caspase-3引起细胞最终凋亡。还有资料证实［28］，caspase-12－/－大鼠对ERS诱导的凋亡具有抵抗作用，而对于其他途径诱导的凋亡敏感性不变，进一步说明了ERS介导caspase-12凋亡途径。而M.SHIBATA等也在他们的实验研究中指出［29］，局灶性脑缺血/再灌注损伤引起内质网应激，激活caspase-12，诱导神经元凋亡。最近的研究也表明，对原代培养的大鼠神经元，进行缺氧复氧损伤或谷氨酸损伤，能引发ERS，上调caspas-12表达，而牛磺酸通过抑制ATF6和IREα通路减弱ERS，发挥细胞保护作用［30］。但是，目前，caspase-12只在大鼠和小鼠体内被克隆［31］。研究发现，人类的caspase-4与鼠caspase-12具有高度同源性，在内质网介导的凋亡途径起到重要作用［32，33］，可能是脑卒中潜在的治疗靶点。

2.3.2 CHOP转录激活 CHOP是内质网应激特异的转录因子，属C/EBP转录因子家族成员，也称GADD153。正常情况下，胞内CHOP表达十分低。当ERS时，其表达明显增加。ERS使跨膜蛋白IRE1和ATF6活化，其胞质部分进入胞核，与ERSE保守序列相连，而启动CHOP的转录和表达。此外，PERK通路激活，磷酸化 eIF2α增加，诱导转录因子ATF4表达，ATF4可与CHOP启动子的氨基酸反应元件位点结合，激活CHOP。PERK信号激活在ERS早期通过抑制蛋白质合成对细胞起保护作用，但 ERS时间过长，持续的PERK信号诱导CHOP表达而促进细胞凋亡［34］。

很多资料证实，内质网应激诱导剂thapsigargin和tunicamycin均可使CHOP表达上调，促进凋亡;对原代培养的大鼠心肌微血管内皮细胞，进行缺氧/复氧损伤，CHOP表达升高，细胞凋亡增加;而缺氧预适应则通过下调其表达，减少缺氧/复氧引起的细胞凋亡［35］。研究证实［36］，小鼠脑缺血损伤后在相同时间点当CHOP表达升高时，GRP78的表达会降低，表明CHOP的表达可破坏GRP78保护机制而诱导神经元凋亡。另有资料证实，大鼠短暂局灶性脑缺血海马CHOPmRNA水平升高。而且，在双侧颈总动脉结扎的小鼠缺血模型，CHOP－/－小鼠梗死面积要小于野生型小鼠。越来越多的资料证明，CHOP表达增加是ERS引起细胞凋亡的重要原因。关于CHOP凋亡通路，可能有以下几种:(1)CHOP下调Bcl-2水平，上调Bcl-2家族成员BH3的预凋亡基因Bim，使细胞对ERS的敏感性增加［37］;(2)CHOP的目靶基因可能是TRB3，研究发现，剔除TRB3基因的表达可以降低ERS诱导细胞凋亡的能力［38］;(3)CHOP可能通过上调巯基氧化酶Ero-1的水平，使Ero-1作为活性氧簇的副产物而激活凋亡程序［39］。综上所述，CHOP表达可能与细胞凋亡密切相关。CHOP可能是治疗继发性脑损伤中一个重要靶点。

2.3.3 c-jun氨基末端激酶(JNK)诱导的凋亡途径 ERS时，IRE1激活c-jun氨基末端激酶(JNK)，诱导凋亡。一种方式是:c-jun氨基末端激酶磷酸化TRAF2，再与caspase-12作用，促进其聚合和活化;另一种方式是:IRE1/TRAF2/凋亡信号调节激酶1(ASK1)形成复合物，激活c-jun氨基末端激酶，依赖线粒体/Apaf-1途径诱导细胞凋亡［40］。有资料显示，在ASK1－/－细胞中，ERS则不能诱导JNK的激活以及细胞凋亡，表明ASK1是ERS诱导JNK的激活以及细胞凋亡所必需的。最近的研究也表明，脑缺血/再灌注损伤的病理过程中，NO生成可以激活ASK1，从而进一步激活其下游的的JNK 通路［27，41］;此外，有人认为再灌注早期 CHOP 转录激活是导致再灌注损伤的主要原因，它和caspase-12的激活导致ERS级联反应发生，诱导细胞凋亡［27］。而c-jun氨基末端激酶对caspase-12诱导的凋亡途径影响更为显著。该研究提示，脑缺血/再灌注早期应用c-jun氨基末端激酶的抑制剂，可减弱ERS和细胞凋亡，减轻脑缺血/再灌注损伤。

3 小结与展望

脑缺血/再灌注损伤的病理生理过程中，细胞内Ca2+平衡紊乱，ROS和NO产生增加及炎症反应等均能触发ERS。GRP78作为ERS敏感标志物，其表达的增加提示缺血/再灌注出现了ERS。在Yajing Yuan缺血后处理保护I/R损伤的研究中［42］，缺血后处理增加 GRP78的表达，降低脑组织CHOP表达，降低casepase-12活性，表明缺血后处理也可通过抑制内质网应激诱导的细胞凋亡发挥脑保护作用;已有资料证实，依达拉奉不论对脑缺血/再灌注的动物模型还是对脑卒中病人均能减少脑梗塞面积和脑水肿［43－44］，其神经保护作用实验证实也与其减少CHOP和capase-12的表达有关［45］。Nakka 等研究表明［4］，大鼠脑缺血/再灌 注 后，GRP78、caspase-12、CHOP/ATF4 及 XBP1 表达上调，对 eIF2α去磷酸化的抑制能增加eIF2α磷酸化的表达，对抗ERS，减轻脑缺血/再灌注损伤。

综上所述，ERS凋亡途径是脑缺血/再灌注过程中神经元死亡的重要方式之一。研究脑缺血/再灌注损伤和ERS的关系能为脑卒中的研究提供重要理论基础，抑制内质网应激有望阻止脑缺血后的病理过程，这将为脑卒中的治疗和药物发现提供新思路。

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