结肠癌肿瘤干细胞标志物研究进展

谢光洪(综述),赵 逵(审校)

(遵义医学院附属医院 消化内科，贵州 遵义 563099)

结肠癌肿瘤干细胞标志物研究进展

谢光洪(综述),赵 逵(审校)

(遵义医学院附属医院 消化内科，贵州 遵义 563099)

肿瘤干细胞；结肠癌；表面标志物；共表达

结肠癌是严重威胁人类健康的一种消化道恶性肿瘤，其发病率和致死率呈逐年上升趋势。研究发现结肠癌的发生和发展是一个涉及多基因、多阶段、多因素异常积累且相互作用的复杂过程。直到目前为止其具体发生机制尚不是很清楚，但是研究者们认为结肠癌的发生主要有以下几种理论：一是“腺瘤-癌”理论，80%以上的结肠癌都是来自于这条途径；二是“基因突变”理论，个别基因发生突变后慢慢积累直到改变了原来的遗传物质从而导致肿瘤的发生；三是“炎症-癌”理论，现在比较新的观点是炎症就是一种癌前病变，如果炎症没有得到有效的控制经过一段时间后就会发展为癌症，结肠炎最终演变为结肠癌就属于这一类；四是“肿瘤干细胞”理论，即研究者认为在肿瘤中存在少量的肿瘤干细胞，它们是肿瘤细胞的“祖先”，能够分化成肿瘤细胞。现主要论述肿瘤干细胞理论。

1 肿瘤干细胞

肿瘤干细胞[1](Cancer Stem Cell)是一类能自我更新、无限增殖并具有多向分化潜能的含量极少的细胞，这类细胞在肿瘤细胞中所占的百分比不足1%。极少量这种细胞就能分化成新的肿瘤细胞进而增殖形成肿瘤。20世纪70年代Nowell等[2]首先在白血病患者组织中提取出了极少量这种具有无限增殖潜能的细胞， 并将它以极低浓度移植到具有严重免疫缺陷的小鼠身上，发现这种细胞能进一步增殖并形成和原来表型相同的细胞，由此提出了白血病干细胞理论。近年来，它已经扩展到包括脑、乳腺肿瘤和结肠癌等实体瘤中。后续研究发现CSC不完全一样，它具有明显的异质性，可分为增生、耐药、侵袭和转移等行为不同的亚群细胞。目前对肿瘤干细胞特性和功能的研究成为肿瘤生物学研究的热点。

2 结肠癌肿瘤干细胞标志物

肿瘤干细胞研究的关键是如何从肿瘤组织或者肿瘤细胞中分离出肿瘤干细胞。目前主要有三种方法进行分选：①采用无血清培养细胞抱团生长形成细胞球；②Hoechest荧光染料法；③表面标志物分选法，比较常用的分选手段有流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法。两种方法都是利用肿瘤干细胞表面特异的分子和相应的抗体结合，从而分离出结肠癌干细胞。研究发现结肠癌中比较特异的标志物主要有CD133 、CD44、CD166，以及ALDH1和LGR5等。2003年Al-Hajj[3]等通过特异的细胞表面标志ESA+CD44+CD24-分离出了乳腺癌干细胞。不久，研究者们又相继分离出了结肠癌、肝癌、脑癌等肿瘤干细胞。由此证实了在肿瘤干细胞表面有相关标志物的表达。为确定分选出来的是否是肿瘤干细胞，必须得比较其不同干细胞亚群间的增殖克隆能力、分化潜力等。验证肿瘤干细胞的金标准是通过动物接种实验来比较干细胞群的成瘤能力，如果用极低浓度的干细胞移植入动物体内不久会产生肿瘤而且表型和原来一样，那么这种细胞就是肿瘤干细胞。下面介绍几个典型的结肠癌干细胞标志物。

2.1 CD133 CD133[4]是肿瘤干细胞的表面标志物之一，1997 年 Miraglia[5]等发现一种新型造血干细胞标志物AC133 蛋白，该蛋白在第七届国际白细胞分化抗原工作组会议(mDAW)上被正式命名为 CD133。它由C端和N端组成，C末端结构域在细胞质内，N端结构在细胞膜上。研究表明CD133是很多肿瘤的表面标志物，与肿瘤的侵袭和转移有关。Vitianil等对结肠癌进行研究发现结肠癌中有CD133+细胞的表达。 2006 年O’Brien等[6]从人结直肠癌手术切除标本中分离到1.7%～22.4% CD133 +细胞，并通过有限稀释法，将不同浓度的 CD133 +细胞接种 NOD/ SCID 小鼠肾被囊，复制出原肿瘤细胞，且肿瘤细胞在生长过程中没有出现明显的表型变化，证实了 CD133 +的人结肠癌干细胞具有自我更新和分化、重建成结肠癌细胞群体的能力。因此，CD133可以作为结肠癌肿瘤干细胞的表面标志物。

2.2 CD44 CD44是一个糖基化的细胞表面黏附分子，广泛分布于T淋巴细胞、纤维母细胞、上皮细胞以及内皮细胞[7]。CD44+的细胞能够刺激新生血管的生成，促进肿瘤细胞的生长和侵袭转移[8-9]。大量的研究发现 CD44在多种肿瘤细胞中均有高表达，在转移性结肠癌中 CD44分子表达增强，与结肠癌转移及预后关系密切，其表达水平是结肠癌细胞转移潜能和预后的标志[10-11]。最新研究显示结肠癌细胞株HT-29里面CD44+分子的百分比为80%以上。CD44+分子在干细胞中的阳性率约为0.22%。因此可以用CD44来分选结肠癌肿瘤干细胞，CD44+的细胞具有很强的成瘤能力，它还能与CD166(白细胞活化黏附分子)联合运用分选肿瘤干细胞。研究证明敲除CD44基因会使结肠癌干细胞丧失成瘤能力，说明CD44分子在维持肿瘤干细胞干性及调节肿瘤干细胞生物学方面起着重要作用 。

2.3 CD166 CD166是一种活化的白细胞粘附分子，属于IgG超家族的一种跨膜分子，是淋巴细胞CD6的一种配基，和CD6可以相互作用介导细胞之间的粘附，并与介导T细胞的功能调节相关[12]，这种分子主要在结肠癌干细胞表面表达。CD166分子表达降低可以使肿瘤细胞的粘附能力下降，最近研究认为CD166分子在肿瘤干细胞的相互作用中起了重要作用，并调控干细胞的分化。后来研究发现CD166在神经系统肿瘤、白血病干细胞中亦有表达。目前CD166分子被认为是一种潜在的新型的结肠癌标志物之一，并作为抗癌药物的作用靶点。这种分子在结肠正常组织中无表达，在腺瘤及癌组织中部分表达,但癌组织中表达较腺瘤明显增高，其表达与结肠癌细胞的分化程度相关。WEICHERT 等[13]通过western-blot发现在结肠癌CD166蛋白质表达水平显著高于正常大肠组织，利用RT-PCR检测大肠癌CD166 mRNA的表达情况，发现其阳性率显著高于正常大肠组织, 由此推测CD166在结肠癌的发生及发展中扮演着重要角色。

2.4 乙醛脱氢酶1(ALDH1) ALDH1是一个与肿瘤干细胞代谢有关的一种酶[14]，它的作用主要是将干细胞内乙醛氧化为乙酸。研究发现活化的ALDH1对烷化剂具有很强的耐受性及抗氧化能力，因此它能够导致肿瘤耐药性的发生。最近研究中Ginestier[15]等证实ALDH1是一种新的乳腺癌肿瘤干细胞标志分子，也是乳腺癌患者预后的独立危险因素。结肠癌中ALDH1+高表达的细胞能够作为结肠肿瘤干细胞[16]的一个标志物。ALDH1一般处于结肠的隐窝组织中[17-18]。结肠炎病人在隐窝组织中的的ALDH1的含量会增高，癌组织中更高。ALDH1已经在白血病，乳腺癌和脑癌等肿瘤中被证实存在，现在在结肠炎性结肠癌中也被证实存在。利用离体实验证明，ALDH1不断升高的人结肠癌上皮细胞具有干细胞特性。ALDH+的细胞中包含一个亚群细胞，这个亚群细胞能够作为细胞和分化潜能和最大的生长能力标志。结肠癌中，高表达的ALDH1证明能够致瘤，就像其他肿瘤一样并且具有自我更新的能力。在大量实验中证明，通过免疫染色发现，ALDH1的表达和肿瘤的预后有关。将ALDH1阳性的原发性肿瘤移入具有免疫缺陷的小鼠，以此来决定肿瘤起始和分化潜力。观察2个月，发现85%以上的小鼠患上了肿瘤。以上这些发现为结肠癌肿瘤干细胞理论的研究提供了一个重要而崭新的方向。

2.5 LGR5 LGR5属于G蛋白偶联受体家族，最初是从结肠癌细胞中分离出来的[19-20]。Lgr5是含有18个富含亮氨酸的重复单位和7个跨膜区域组成的大分子蛋白，是最新发现的Wnt途径的靶基因，还是潜在的干细胞标记物，并且与肿瘤的形成和发展都有很大的相关性，是结肠癌肿瘤干细胞具有相对特异性的一种蛋白质，它位于结肠的基底隐窝细胞内，大部分在胞浆(细胞质中)表达，膜上有少部分表达。LGR5蛋白在结肠癌干细胞中的阳性率达56.3%。LGR5阳性的细胞可能包含有更多的肿瘤干细胞，并且LGR5表达的增加和肿瘤浸润深度，淋巴结转移和远处转移有关。并在结肠癌的恶化和预后方面扮演了重要角色，可以作为治疗效果的一个指标。研究发现LGR5是干细胞Wnt/B-catenin信号通路中最好的一个干细胞特异性标志物。荷兰学者Barker等[21]研究发现，LGR5 在小肠和结肠隐窝特异性表达，并证实LGR5为小肠和结直肠肿瘤干细胞标记物。McClanahan等[22]研究发现，利用 RNA干扰技术敲除培养的结肠癌细胞中表达的LGR5基因，肿瘤细胞凋亡下降。Yui等[23]将一个LGR5+结肠肿瘤细胞植入到小鼠体内，不久小鼠长出一个肿瘤，细胞表型和原来的表型一样。研究还发现在转移性结肠癌细胞系中Lgr5的表达较高。此外，Lgr5家族可介导R-脊柱蛋白参与Wnt 经典信号通路[24-25]，并证实Lgr受体与R-脊柱蛋白密切结合，即使是少量Wnt信号刺激时也能够增强Wnt的信号作用，进而参与肿瘤的发生。Carmon等[26]关于Lgr5与Wnt受体的相互作用的研究表明Lgr5是Wnt信号复合体的一部分，并在膜水平增强Wnt/β-catenin信号。关于Lgr5是如何增强Wnt信号的机制依然不清楚。因此，Lgr5是目前对结肠癌肿瘤干细胞最具有特异性的一个标志物。

3 结肠癌CSC标志物共表达

为了研究结肠癌肿瘤干细胞的生物学特性， 如何从组织或细胞中分离出肿瘤干细胞是关键的一步。目前最常见的方法是利用一个或几个干细胞表面分子抗体分选肿瘤干细胞。研究发现，在结肠癌肿瘤干细胞表面标志物存在共表达的现象。即同时有不同的肿瘤标志物分子在同一肿瘤干细胞表面表达。这种现象为提高肿瘤干细胞的分选率打开了另外一个视野。现在研究中用的比较多的是CD24联合CD29分子，或者用CD44联合CD166分子共同分选结肠癌肿瘤干细胞。

4 展望

肿瘤干细胞理论已经在相关肿瘤中得到了证实，但是对它的研究尚处于初步阶段。结肠癌肿瘤干细胞理论更是使人们对结肠癌的发生、生长、转移和复发等方面有了全新的认识。但是结肠癌肿瘤干细胞和正常干细胞之间的关系究竟如何，以及怎么寻找结肠癌肿瘤干细胞的特异性标志物，以此来分离和纯化肿瘤干细胞等将成为研究的热点。随着现代分子生物学和细胞免疫学的不断进展，将来可能发现更多具有特异性的肿瘤干细胞标志物，对这些肿瘤干细胞进行生物学特性和分子免疫学等研究，并以这些异性标志物为药物治疗靶点，那么我们有理由相信将来人类克服肿瘤的这条道路会变得更加平坦。

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贵州省高层次人才科研条件特助经费资助项目(NO：TZJF-2011-32)。

赵逵，男，教授，硕士生导师，研究方向：大肠癌,E-mail:kuizhao95868@MSN.com。

R735.3

A

1000-2715(2013)05-0491-04

[收稿2013-06-03;修回2013-07-10]

(编辑：王福军)