干细胞复合生物纳米人工气管支气管移植

Jungebluth P 著 郑凯 谭建明 译

长久以来，人造器官一直是医生与患者的共同梦想。2011年7月，瑞典卡罗林斯卡大学医院(Karolinska University Hospital)的胸外科医生保罗·麦斯尔尼(Paolo Macchiarini)等团队完成世界上首例自体干细胞复合生物纳米人工气管移植手术，首次将一个完全“成长”于实验室中的人造气管成功移植入患者体内。这是继2008年该团队成功完成世界首例组织工程气管移植后又一重大突破，是全球首例成功的人工培养器官移植手术，在医学界被认为具有里程碑的意义。2011年11月24日《柳叶刀》（The Lancet）杂志在线发表该项研究成果，现回顾相关内容供同道分享！

瑞典学者Paolo Macchiarini等团队研究发现，对有复杂气道缺陷的患者，或可进行人造气管支气管移植治疗。研究对象为1例36岁原发气管黏液表皮样癌患者，曾接受过手术和放射治疗，出现终末端气管和双侧主支气管原位癌复发。由于肿瘤范围较大，已无法手术切除或原位重建。

研究人员首先借助三维成像技术，将患者的气管结构进行了三维扫描。伦敦大学学院(University College London)纳米技术和再生医疗学教授亚历山大·席法利安(Alexander Seifalian)等团队以这些图像为依据，用纳米复合材料（POSS-PCU）“量身订做”患者气管和双侧主支气管的主体支架。随后，这些支架被送往瑞典。提取患者骨髓干细胞，配制成细胞悬液后放入“内呼吸”(InBreath)生物反应器(Harvard Bioscience)中。将纳米复合材料气管支架浸泡在细胞溶液中，在生物反应器中旋转的时候保持温暖无菌状态。37℃共同孵育36 h，使骨髓干细胞黏附到支架上，并且生长发育成组织。移植手术术中再次补种骨髓细胞和呼吸道内膜细胞。在将肿瘤完全切除后，使用已种有自体骨髓单核细胞的纳米材料生物支架替代已切除的气道。患者术后接受粒细胞集落刺激因子非格司亭(10 μg/kg)和促红素β(40 000 IU)治疗2周。

移植术后患者恢复良好，未发生严重并发症。由于器官来源于患者自身，所以未发生任何排异反应。移植后5个月，患者无任何症状、亦无肿瘤复发。人工气道的生物纳米材料与正常气道组织互相吻合良好。人工气道覆有血管化的新生黏膜，部分覆盖有几近正常的上皮组织。在经生物发生器将单核细胞种植于支架后，支架逐渐被细胞外基质包被并有CD105+细胞增殖。外周细胞的迁移使得间充质基质细胞表型表达增加，促红素受体、抗凋亡基因、miR-34和miR-449等生物标志物表达上调。这些结果连同与再生相关的血浆因子表达水平升高表明了干细胞归巢和细胞介导的创面修复、细胞外基质重塑及植入物的新生血管化。

2008年该团队曾成功完成世界首例组织工程气管移植，支架采用的是捐献者气管的胶原蛋白骨架。而此次采用的支架则完全来自人工创造，选用了新型纳米材料为载体。它的成功意味着未来患者不再需要苦苦等待供体，而随时可以获得一个适合的器官。

流行病学研究表明：由于诊断的困难，大多数原发性恶性气管肿瘤患者确诊时已不再适合手术治疗(病变超过6 cm或>50﹪总气管长度)，而被迫采取姑息性治疗。这些患者预后差，5年生存率约为5﹪。此外，由于气管重建存在困难，即使在可以手术的患者，完整切除肿瘤的比例也小于60﹪。如果拥有一个类似于原气管解剖、生理和生物力学特性的可替代气管，这一状况将大大改善。在2008年，本研究团队首次报道了应用组织工程构建的气管移植，采用捐献者的气管作为支架，植入从受者骨髓中提取出来的间充质干细胞（MSC）和呼吸道内膜细胞。然而，这种方法存在局限性，如缺乏适合受者适当大小的捐献器官等。本研究使用了一种定制的人造支架，在体外植入单核细胞和生长因子诱导的内源性干细胞，并把这一人造气管移植在1例复发的气管肿瘤患者获得成功。

患者36岁，诊断为原发性气管粘液表皮样癌，2011年5月住入卡罗林斯卡大学医院（瑞典）。主要症状为喘鸣、咳嗽和呼吸困难，曾行肿瘤切除术和术后局部放射治疗（70 Gy）。现肿瘤复发，累及远端气管和双侧主支气管。患者接受了全面检查，包括（18F-FDG）PET扫描，呼吸道黏膜活检和骨髓活检。结果显示没有局部或远处淋巴结和器官转移。根据手术标准，肿瘤累及范围已经超出手术切除及原位重建可能，因此为患者推荐进行人造气管移植。患者签署知情同意书，并得到科学伦理委员会批准。

根据患者胸部CT和三维的容量数据，应用纳米复合材料（POSS-PCU）制造气管支架。首先，根据患者气管支气管的结构、大小和形态，制造一个Y形的三维玻璃芯棒。再应用POSS-PCU材料制造类似于气管支气管软骨环组织的U形环放置在芯棒上。然后将整个模具放置在POSS-PCU溶液中，凝固后形成一个固态多孔的支架。一个成熟的完全适应需求可用于移植的Y形生物人造气管支架构建完成。

采用密度梯度分离法从患者骨髓中收集MNC，并进行血白细胞、单核细胞、CD34+细胞分析；细胞活力与克隆形成能力检测；流式细胞特性检测和细菌检测。细胞在低糖Dulbecco调整的Eagle’s合成培养基 (invitrogen, stockholm, sweden)中重悬。将细胞溶液放入生物反应器中，再将支架浸泡在细胞溶液中，37℃共同孵育36 h，使细胞种植在人工合成的气管支架上。

移植前再次收集骨髓，分离提取MNC。术中再次种植新提取MNC 1次，并加入生长因子：重组人转化生长因子-β3 (R&D Systems, Minneapolis,MN, USA; 10 μg/cm2)、粒细胞集落刺激因子G-CSF(Neupogen;Amgen Europe BV, Breda, Netherlands;10 μg/kg)和 重 组 促 红 细 胞 生 成 素 β(Roche,Grenzach-Wyhlen, Germany; 40 000 UI)。对移植物切片进行检测，包括扫描电子显微镜、荧光和亮视野光学显微镜、共聚焦活细胞成像检测，结果显示生物纳米人工气管完全满足于临床需要。

采用全身麻醉，根据手术原则决定气管切除范围。因为上次手术和放射治疗造成疤痕组织形成，心包内肺动脉须连同肿瘤一同切除，选取人工血管Dacron 8F(Gelsoft, Vascutek, Terumo, Ann Arbor, MI,USA)，连接背主动脉和心包外肺动脉，阻断上下腔静脉26 min。气管切除范围包括其远端气管6 cm、整个右主支气管和左主支气管起始处2 cm，冰冻切片显示所有的切缘肿瘤阴性，完整的切除纵隔淋巴结。移植入生物纳米人工气管，顺序吻合右和左主支气管，然后吻合近端气管重建气道，网膜包裹植入物，逐层关闭胸腹切口。根据临床经验，术后早期如果出现咳嗽反射，粘液清除障碍和胸廓动度受限，在高于植入物位置行临时气管切开术。

为促进再生过程，患者皮下注射治疗药物G-CSF (10 μg/kg)和重组促红素 -β(40 000 UI)，移植前1 d给予起始剂量，术后2周隔天1次。

术后7 d每天行内窥镜检查移植物和吻合口。住院期间每周行支气管镜检查，此后每月检查1次，同时进行人造生物移植物活检，行HE染色、免疫组织化染色、过碘酸希夫染色和Masson’s染色法检测。移植后2周隔天测定血清Micro-RNA和血浆可溶性因子 (ELISA)。通过梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)，术前2 d和术后2周行细胞计数、细胞活力检测、基因表达分析、染色质免疫沉淀分析和PBMC表型流式细胞仪检测。

结 果

移植术后24 h患者清醒。术后第2天出现右上叶肺炎，给予广谱抗生素治疗后好转。患者逐步恢复，并于术后第5天去除机械通气。手术后1周行支气管镜检查，在内镜接触的人工气道内层可见出血。临时气管切开插管于18 d后去除。移植后2个月活检标本显示：人工气道大部区域有新生上皮组织和血管形成，无细菌或真菌污染。5个月后呼吸正常，无肿瘤，肺功能较术前相比明显改善。

micro-RNA表达分析结果：气道上皮分化的生物标志物miR-34和miR-449血清水平在移植后2 d较术前相比表达上调。用于标准化血清miRNA水平的miR-16血清水平没有改变。

应用扫描电子显微镜观察生物反应器中孵育的细胞，用共聚焦显微镜观察暴露于生物材料的静态活细胞，支架内的细胞呈现出不同的形态，如长的凸起、丝状或板状伪足，锚定在支架上。尽管因为材料的短缺使研究人员无法对细胞分裂进行更为深入的观察分析，但还是观察到一些新细胞分裂，生物反应器中细胞的密集聚合提示细胞克隆扩增。CD105阳性染色证明存在间充质细胞系的亚群。流式细胞仪表型检测结果：生物反应器培养介质中的MSC和HSC在种植过程后出现选择性下降，CD90+CD59-细胞数量明显减少，说明它们已很好地附着和种植在支架上。

细胞计数和血浆内细胞因子检测结果：外周血流式细胞仪分析显示HSC在第6天增加，尤其CD90+细胞亚群数量明显增加。在术后第2天，循环MSC数量升高到同年龄性别健康捐献者的15倍水平，可能是因为术前诱导刺激治疗的结果；到第4天和第6天下降到3倍水平；到第10天下降到2.5倍水平。趋化因子SDF-1受体CXCR4的表达水平在术后第2天也明显升高。

干细胞表型分子分析(染色质免疫沉淀反应)结果：促进性因子H3K4me3在术后显示出稳定的浓度，而抑制性因子H3K27me3在术后4 d和6 d出现下降，共同结果是增加了细胞分化相关基因SOX2的总活性，这种效应在第10天得到进一步增强。另一个细胞分化相关基因GNL3也显示出相同结果。这些染色质状态和基因表达的结果与流式细胞分析结果相一致。

JAK/STAT途径是被重组促红素beta激活的一个主要信号转导通路，检测PBMC中JAK/ STAT途径基因的表达，发现大多数基因在术后4 d显示为逐步下降，随后在第6、10天逐步恢复。PBMCs抗凋亡基因分析显示BCL2L1和EPOR在第6天出现表达峰值。

讨 论

本个案研究结果显示了自体干细胞复合生物纳米人工气管移植的可行性。尽管组织工程器官和复杂组织的临床移植取得很大的进展，但尚无一种安全、合适的气管替代临床解决方案。本研究利用生物反应器系统，将MSC体外扩增和转化为自体软骨细胞和自体上皮细胞，构建完全人工的组织工程气管，并首次将其应用于临床移植获得成功。本研究团队曾应用人捐献的去细胞气管作为支架，通过在移植物内种植自体细胞(骨髓MSC和呼吸道细胞)，并应用转化因子和组织保护因子进行培养，随后用于良性或恶性的呼吸道疾病患者获得成功。然而，这种方法有一定的局限性。例如：需要长时间的去细胞过程(15～20 d)；需要适合患者大小的捐献气管；自然基质成分改变的风险；移植物在体外细菌污染以及最重要的是要求获得一个捐赠器官。

患者的原发性肿瘤侵及支气管分叉和远端气管5 cm，是手术切除的绝对禁忌症。患者尽管接受了70 Gy的放射治疗，仍然出现肿瘤复发并伴有严重喘鸣，而等待捐献时间是不可预测的，所以本研究决定尝试一种新的治疗方法，既应用基于POSSPCU纳米复合材料完全人工的气道来置换手术切除的气道部分。这一方案基于以下事实：POSSPCU具有生物相容性、无毒、不可降解、惰性、可以忽略不计的免疫反应性等特点；另外，它具有机械属性、体内化学稳定性、纳米结构等特性，决定了POSS-PCU是生物工程气管移植的理想材料。

以前曾尝试过的各种合成材料一直未获得成功，原因包括：细胞种植失败、感染、移动、狭窄和坏死等。这些缺陷导致气管并不位于间质环境中，而是直接接触呼吸道空气，使感染和污染更容易发生。因此本研究利用一个生物反应器环境，使自体单核细胞植入生物人工支架。结果表明，在生物反应器内36 h的动态孵育足以使单核细胞附着于生物材料。经过2 d种植后，暴露在生物反应器中的细胞形成密集细胞团，而静态孵化的细胞表现为均匀分布，表明生物反应器可能帮助巢状细胞团增殖。抗体标记和形态分析显示移植物内存在间充质细胞表型CD105+的细胞增殖，而非造血细胞表型。尽管在经过生物反应器中细胞种植后的支架上可以观察到一个细胞外基质(ECM)样结构，但这一结构是来源于自体血清还是种植细胞尚不清楚。

最常见的肺移植后气道并发症是坏死、裂开、狭窄、可能与移植相关的局部缺血。在本研究中，一个无血管的Y形纳米复合材料被植入患者体内，最初并发真菌感染在移植4个月之内治愈；随后腔内表面部分覆盖呼吸道黏膜，几近健康的上皮组织和内皮增生。这些证据表明，一个生物工程合成的纳米复合材料气管支气管可以在体内细胞化，进而转变为活的具有功能的结构，与邻近组织完全结合在一起。气道上皮分化生物标志物miR-34/449检测结果显示患者术后存在气道上皮的分化过程。

合成物移植需要解决的关键问题之一是在移植后招募修复细胞，促进新移植材料的整合和重塑。有助于再生的细胞成分可以来源于局部组织或循环祖细胞。本研究观察到HSC动员和循环MSC数量增加，这与先前报道的G-CSF作为唯一动员药物不会动员MSC的结果有所不同。事实上，在植入部位手术诱导产生的炎症反应、细胞因子和毒素释放可能是MSC动员的原因。研究发现大量与伤口愈合相关水溶性介质的释放，这可能促进MSC动员，正如先前其他研究人员报道的结果。另外，G-CSF可以诱导嗜中性粒细胞扩增和蛋白酶释放，可以促进祖细胞动员。植入物诱导局部产生的血液活化物质，如C3a和凝血酶，可以增强骨髓祖细胞的活化、募集、组织修复和和局部的免疫抑制。研究还发现强大的生长因子和基质金属蛋白酶的系统性释放，可能是募集的祖细胞和其他免疫细胞释放产生。此外，研究人员记录到重组促红素受体早期表达增加，及BCL2L1等抗凋亡基因表达上调。在炎症反应过程中，创伤相关细胞因子被释放，促进促红素受体表达，并通过降低局部促红素与促进细胞凋亡来抑制组织保护作用。为了避免这种术后早期局部促红素的缺乏，给予补充重组促红素(500 UI/kg)，目的是促进和触发早期局部组织的保护作用和再生。

综上所述，以上结果证明了首次生物工程人工支气管临床移植的成功完成，也为这种方法的可行性提供了进一步的证明。

评论：《柳叶刀》杂志在近3年内刊登了3篇关于组织工程器官替代人体组织器官临床应用获得良好疗效的文章。上述瑞典研究团队先后应用捐献者人体气管以及新型纳米支架材料为载体复合受者骨髓基质干细胞成功修复了气管肿瘤切除后的气道。另一研究团队则成功地将组织工程血管用于血液透析过程。上述研究从临床的角度证明了利用体外人工的方法模拟体内器官的生物学特性和解剖结构，进而替换各种原因导致废用器官的可行性。

目前国内外均有关于组织工程皮肤以及软骨用于临床的报告。然而，需要清醒地认识到，气管及血管属于相对较简单的腔道组织，对其构建只不过是组织工程器官替代计划跨出的一小步。要成功构建更加复杂的人工脏器(如肝脏、肾脏和心脏等实体器官)，并让其发挥与体内正常器官同等的功效，还有众多科学“难关”须要逾越。

人造器官的宏伟规划描绘了一幅美好的愿景，如同所有人类科学的进步，只要秉着坚定的信心不懈努力，相信在不久的将来，适合每个个体的人造器官可在“人造器官银行”中任意提取。人造气管、血管的成功构建及临床应用已经敲开了人造器官时代到来的大门。

(本文编译自：Jungebluth P, Alici E, Baiguera S, et al. Tracheobronchial transplantation with a stemcell-seeded bioartificial nanocomposite: a proofof-concept study[J]. Lancet, 2011, 378(9808):1997–2004.）