血清反应因子在心血管疾病中的作用

钟泽 胡家庆

血清反应因子在心血管疾病中的作用

钟泽 胡家庆

血清反应因子（serumresponsefactor，SRF）属于MADS转录因子家族的成员之一，是高度保守且广泛表达的转录因子。SRF在成年或发育期的心肌组织中均有表达，主要与下游靶基因启动子上特定DNA序列CArG盒[血清反应元件（SRE）的组成部分，CC（A/T）6GG box]结合，调控抗凋亡或促细胞增殖等基因（如IEGs：c-fos、mcl-1、Egr-1）的表达，对外界因素（如：缺血、缺氧等）刺激表现出快速的基因响应，影响心肌细胞的发育、分化、增殖及凋亡[1-2]。许多辅助转录调节因子蛋白（coactivator/co-repressor，如TCF家族成员Elk-1和MRTFs家族等）与SRF/SRE发生相互作用，激活与心肌分化、增殖及凋亡相关基因的转录。因此，对SRF-CArG box依赖基因转录的调控，是影响心肌凋亡/生存的关键因素之一[3]。另外，研究表明skeletal a-actin、b-MHC、cardiac a-actin、MLC-2v、dystrophin等收缩类蛋白[4-6]及非收缩类蛋白，诸如参与心脏功能的ANF、肌质网Ca-ATPase（SERCA2）、Na+/Ca2+交换离子通道 NCX1[7-8]均为SRF依赖的基因。由此可见，SRF在调控收缩蛋白基因和收缩功能器官的重要作用充分说明SRF在心脏功能中发挥着重要的调控作用。

1 血清反应因子与细胞转化的关系

越来越多的证据表明，SRF可能参与了不同的源细胞的转化过程。根据不同的细胞类型，SRF可以促进或抑制细胞的转化，这最终决定了与SRF相互作用的细胞内可用因素的种类和数量。恶性潜在血管平滑肌肿瘤与平滑肌G-肌动蛋白的消失有着一一对应关系，并且与肿瘤平滑肌组织相比，正常细胞中可发现SRF/ MEF2/NK-2特异性捆绑形成一个包裹的复合物，其在肿瘤转化期间随着核SRF可移性发生改变[9]。其他的研究表明,经历了间充质转变后，SRF在上皮肿瘤细胞中过多和高度活跃性。SRF DNA结合活性升高与SRF本身增加的表达,与肌动蛋白和黏连蛋白等所有依赖于SRF的基因呈线性关系。这些变化同纺锤状形态的获得一样都是依赖RhoA信号通路[10]。

2 血清反应因子对心肌肥大的影响

很多SRF调控的基因都与心肌的发育和肥大有关，这就提示SRF很有可能参与了心肌结构多数功能性的基因调控。在心肌肥大反应过程中，存在一类功能性紊乱的基因，这类基因表达与正常胚胎发育时的表达相似，这种现象被称为感应胎儿基因程序（induction of the"fetal"gene program）。这些基因包括肌球蛋白α/ β亚型、ANF、skeletal a-actin和原癌基因c-fos[8]。这些基因有着显著的共同特征：具有SRF链接位点，即这类基因的启动子上存在CArG-boxes[11-12]。以上种种迹象都表明SRF是调控induction of the"fetal"gene program的重要转录因子。经过研究表明老龄啮齿动物发生心肌肥大都伴有SRF表达显著升高[13]。

在转基因实验研究也证实了SRF的这一作用，即低水平的野生型人类SRF在幼年小鼠体内持续表达都会导致小鼠心肌肥大（心脏重/体重比列上升）、纤维化、原发性心肌症甚至是幼年小鼠夭亡[14]。另有文献报道，心肌特异性地过表达SRF突变体（dnSRF）的转基因小鼠，SRF不能结合到DNA上，或者不能激活SRF介导的快速转录应答活性，同时还会造成越来越严重的心肌病变并伴有心肌纤维化，严重时甚至导致动物在出生2周内夭亡。对以上小鼠的心脏组织进一步研究发现，虽然病变心脏内总SRF mRNA和蛋白含量上升了，但是结合DNA的能力却下降了。转基因小鼠相对于正常小鼠体型小，并且心肌细胞异常表达SRF依赖的基因 ［（i.e.dysregulation of cardiac a-actin，β-myosin heavy chain,and myosin light chain 2v）］。以上这些研究表明，dnSRF能有效竞争性阻断内源性的SRF结合到靶基因的作用位点，因此阻断了细胞生长、分化中信号转导作用，甚至很有可能还阻断了细胞间的相互作用。在另外一些心脏过度增生的模型中[15]，SRF介导了去甲肾上腺素诱导的TGF-β上调；心肌细胞培养研究发现，c-fos激活PKC也是由SRF介导的。SRF介导的这些调节作用可以被YY1抑制。心室肥大细胞skeletala-actin的激活同样需要 SRF的 DNA结合功能[16]，dnSRF能够竞争性地抑制YY1结合到CArG上，上调TGF-β依赖的启动子的表达。

3 肌肉重塑过程中血清反应因子的变化

血管或气管平滑肌细胞在重塑过程或某些疾病（动脉硬化、肺动脉高压等）发生、发展过程中，都会出现异常的平滑肌细胞分裂增殖。淋巴管肌瘤患者的平滑肌细胞，核蛋白S6高度磷酸化，DNA合成增加，p70 S6激酶激活[17]。在这个研究中没有发现PI3K异常激活。那么这种PI3K非依赖性的SRF功能激活是不是参与了异常的平滑肌增殖呢？这些疑问都需要去进一步调查研究。

在心肌衰竭的患者体内发现SRF表型发生了改变[18]。和正常心脏比较，病变心脏SRF△4，5上升，SRF下降。相似的表型改变在实验诱导的兔心力衰竭的心脏内也被观察到了。更为重要的是，SRF△4，5表达会阻断全长SRF表达，而且会下调SRF依赖的基因表达

4 血清反应因子对心力衰竭中的影响

根据第二临床症状，心力衰竭可定义为一种降低心肌能力来适应生理循环系统需求的复杂综合征。引起心脏衰竭的主要病因差异很大,可从结构上的基因突变和收缩蛋白到高血压、缺血性心脏病和内分泌失调。由于在应激生理系统存在一个维持体内平衡代偿机制，心力衰竭中基因的表达方式是一种针对刺激和抑制信号复杂应答的融合体。为了揭示这一过程的分子机制，重要的是要确定影响心肌细胞性能和生长的关键目标基因的表达控制。不同的实验室工作已经证明，SRF是一个许多心脏衰竭过程中表现转录应答基因表达的重要的调节子。这就在调节基因过程上认为SRF有一个潜在的重要角色，也使理解其在心力衰竭中所发挥作用的十分重要的意义。

现在公认的解释为心肌细胞SRF表达失调和/或SRF功能改变不仅诱导了心肌肥大特征基因的早期应答，而且还参与了心力衰竭过程中的基因应答。在严重心力衰竭患者心脏中发现了SRF和caspase的变异体[19-20]。SRF基因很可能发生了突变，翻译出的SRF转录因子丢失了反式激活区，从而阻碍了靶基因的激活[21]。Caspase的C-端具有SRF反式激活功能，心力衰竭过程中，caspase活性不断上升，诱导SRF裂口，产生不含C-端的突变体蛋白，这一突变体不具有SRF反式激活功能，表现出与SRF剪切突变体相似的明显抑制靶基因激活的作用[18]。以上这些研究表明野生型的SRF表达下降或SRF剪切突变体上升都可能下调SRF依赖的基因表达，同时还可能促使严重心力衰竭的发展恶化[19-20]。

综上已经提到，在啮齿动物模型中自发的年龄依赖性心脏肥大与SRF蛋白的增加相关，尽管其发生机制目前尚不清楚，但说明SRF的表达水平增加可能是启动的心肌肥厚基因表达程序的原因[22]。在严重的心脏衰竭期间，研究患者患病的心肌组织发现了所谓的SRF抑制形式的表达增加。尽管它被假定为SRF的抑制形式导致了依赖SRF转录的下调，可存在的疑问是，研究观察到一些基因如ANF（心钠素），可以通过抑制的SRF上调。针对这种SRF抑制形式影响的系统研究还没有文献报道，所以还不清楚有多少其他除了ANF依赖SRF的基因被显著上调了。为了解决SRF过表达介导心力衰竭的作用问题，Wei和同事做了SRF蛋白过表达的心脏转基因模型[23]。他们发现，转基因小鼠与野生型或SRF突变的小鼠相比，其SRF水平的提高会发生心脏衰竭，重要的是在这两种情况下都表现出相似的基因表达模式。这些观测结果说明SRF在心力衰竭中起着复杂的作用。

5 血清反应因子与老化的联系

SRF在衰老中的独特作用还没有完全确定。SRF蛋白质在老年大鼠心脏中的细胞核与细胞质中都比年轻成年大鼠中大量增加了。重要的是，在心肌梗死期间，年轻的成年大鼠的心脏是以增加SRF表达的方式作出反应，而老年大鼠则没有。这种差异的响应可能解释是，与年龄相关的立早基因诱导的下降，以及随后而来的适应应激能力的丢失[24]。令人惊讶的是，另一方面，在与更年轻的细胞相比较时，发现衰老成纤维细胞中SRF DNA的结合能力逐渐下降[25]。这可能起源于衰老细胞内SRF的过磷酸化的出现。这一鲜明的对比可能归因于肌细胞与纤维母细胞间的基因程序的差异。

6 未来研究展望

尽管细胞培养实验和转基因动物模型间有很多明显差别，但它们是作为结果的表达模式而有用的开始比较，其在心肌肥大上两个肥厚模型系统中开始形成有关SRF作用的假说。

虽然由SRF控制心肌细胞基因表达的复杂机制初步确切，且从研究平滑肌系统依赖SRF基因表达获得的数据很可能是有用的。正如已有的文献中所讨论的那样，依赖SRF基因调控的一个典型的特征是，根据SRF与关键辅因子的时间和空间表达，能够在两种对立的基因表达途径中切换，选择拼接变体SRFS，磷酸化SRF和F-actin与G-actin之间的平衡[26]。作为F-actin稳定化的结果，G-actin池的减少通过不充分的特征机制，向核发出信号，并且足以激活依赖SRF基因的表达[27]。有趣的是，SRF靶基因的有SRE且缺乏相邻Ets结合位点，会选择性受肌动蛋白池变化的调节。这表明肌动蛋白能选择性地调节目标基因池与特定的启动子序列的机制。各种SRF辅助因子也可能导致心脏发病机制中SRF介导基因表达模式被发现。在心力衰竭中，有效的转录刺激物——myocardin显著增加，相比之下，正常对照中的抑制性辅助因子——HOP似乎降低了[28]。此外，心肌细胞肥厚性基因的表达受GATA-4调节，其通过磷酸化激活[29]。

尽管一些重大的进展促进了我们对SRF在有丝分裂应答和在心脏和骨骼肌生物学中作用的认识，但SRF在正常或病态的平滑肌中，尤其是心脏和呼吸道平滑肌，其作用还不是完全清楚。SRF参与的转录与后转录调控网络的发现代表着一个巨大的但可行的后基因时代。在人类基因组内可识别所有可能的SRF结合位点。在公认的SRF应答基因中，这些元件的功能意义可由瞬时转染和用缺失突变体方法体内转基因研究证明[30]。此外，现在已经成功地应用与人/鼠基因组的比较，这使得骨骼肌特殊基因中识别出全部的已知SRF结合位点。特别在平滑肌中，包含SRF结合位点基因的发现是由于共表达基因调控区域的定测，这包括近端5＇侧翼DNA以及内含子扩展为成千上万转录启动子序列的基底。

研究数据间接表明，SRF异常的表达和功能失调可诱发增生，肥大，和“激活”平滑肌的细胞。是否在其他血管平滑肌增生疾病中都有SRF的表达和依赖SRF的基因功能的异常调节？如果答案是肯定的，那么在这些情况下长期抑制SRF的功能可能会导致更多的生理性显型。在动物实验中，通过删除SRF基因外显子1，细胞特定表达的cre可以介导SRF重组和切除，因此，功能性的SRF裸细胞应该可以产生[31]。SM细胞特异性可能通过使用SMC特异性启动子完成。用一种现有的和组织/谱系特定的方式，这个针对产生用cre表达的细胞株的突变体双重（或多重）条件的可行性提供了新的工具来研究SRF与其他基因之间的相互作用，并为可能的治疗方法开辟了新途径。

[1]Wang D,Chang P S,Wang Z,et al.Activation of cardiac gene expression by myocardin,a transcriptional cofactor for serum response factor[J].Cell,2001,105(7):851-862.

[2]Tanaka K,Wada N,Ogawa N.Chronic cerebral hypoperfusion induces transient eversible monoaminegic changes in the rat brain [J].Neurochem Res,2000,25(3):313-319.

[3]Da-Zhi Wang,Shijie Li,Dirk Hockemeyer,et al.Potentiation of serum response factor activity by a family of myocardin-related transcription factors[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99:14855-14860.

[4]Davey H W,Kelly J K,Wildeman A G.The nucleotide sequence, structure,and preliminary studies on the transcriptional regulation of the bovine alpha skeletal actin gene[J].DNA Cell Biol,1995,14 (7):609-618.

[5]Gustafson T A,Kedes L.Identification of multiple proteins that interact with functional regions of the human cardiac alpha-actin promoter[J].Mol Cell Biol,1989,9(8):3269-3283.

[6]Henderson S A,Spencer M,Sen A,et al.Structure,organization, and expression of the rat cardiac myosin light chain-2 gene.I-dentification of a 250-base pair fragment which conferscardiac-specific expression[J].J Biol Chem,1989,264(30):18142-18148.

[7]Cheng G,Hagen T P,Dawson M L,et al.The role of GATA,CArG, E-box,and a novel element in the regulation of cardiac expression of the Na+-Ca2+exchanger gene[J].J Biol Chem,1999,274 (18):12819-12826.

[8]Schaub M C,Hefti M A,Harder B A,et al.Various hypertrophic stimuli induce distinct phenotypes in cardiomyocytes[J].J Mol Med,1997,75(11-12):901-920.

[9]Phiel C J,Gabbeta V,Parsons L M,et al.Differential binding of an SRF/NK-2/MEF2 transcription factor complex in normal versusneoplastic smooth muscle tissues[J].J Biol Chem,2001,276(37): 34 637-34 650.

[10]Psichari E,Balmain A,Plows D,et al.High activity of serum response factor in themesenchymal transition of epithelial tumor cells is regulatedby RhoA signaling[J].J Biol Chem,2002,277 (33),29 490-29 495

[11]Hines W A,Thorburn J,Thorburn A.A low-affinity serum response element allows other transcription factors to activate inducible gene expression in cardiac myocytes[J].Mol Cell Biol, 1999,19(3):1841-1852.

[12]Sprenkle A B,Murray S F,Glembotski C C.Involvement of multiple cis elements in basal-and alpha-adrenergic agonist-inducible atrial natriuretic factor transcription.Roles for serum response elements and an SP-1-like element[J].Circ Res,1995, 77(6):1060-1069.

[13]Lu X G,Azhar G,Liu L,et al.SRF binding to SRE in the rat heart: influence of age[J].J Gerontol A Biol Sci Med Sci,1998,53(1):B3-10.

[14]Zhang X,Azhar G,Chai J,et al.Cardiomyopathy intransgenic mice with cardiac-speci?c overexpression ofserum response factor.Am.J.Physiol.Heart Circ[J].Physiol,2001,280:H1782-H1792.

[15]Ueyama T,KawashimaS,SakodaT,et al.Trans-forming growth factor-beta1 and protein kinase C synergis-tically activate the c-fos serum response element in myo-cardial cells[J]. J Mol Cell Cardiol,1998,30:551-562.

[16]MacLellan W R,Lee T C,Schwartz R J,et al.Transforming growth factor-beta response elements of the skeletal alpha-actin gene.Combinatorial action of serum response factor, YY1,and the SV40 enhancer-binding protein,TEF-1[J].J Biol Chem,1994,269:16754-16760.

[17]Goncharova E A,Goncharov D A,Eszterhas A,et al.Tuberin regulates p70 S6kinase activation and ribosomal protein S6 phosphoryla-tion.A role for the TSC2 tumor suppressor gene inpulmonary lymphangioleiomyomatosis(LAM)[J].J Biol Chem, 2002,277:30 958-30 967.

[18]Davis F J,Gupta M,Pogwizd S M,et al.Increased expression ofalternatively spliced dominant-negative isoform of SRF inhuman failing hearts[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2002,282: H1521-H1533.

[19]Gupta M,Davis F J,Jayakar D,et al.A dominant negative isoform of the serum-response factor(SRF)is increased in the failing human heart[J].J Heart Lung Transplant,2001,20(2):160.

[20]Chang J,Wei L,Otani T,et al.Inhibitory cardiac transcription factor,SRF-N,is generated by caspase3 cleavage in human heart failure and attenuated by ventricular unloading[J].Circulation,2003,108（4）:407-413.

[21]Kemp P R,Metcalfe J C.Four isoforms of serum response factor that increase or inhibit smooth-muscle-specific promoter activity[J].Biochem J,2000,345(Pt 3):445-451.

[22]Lu X G,Azhar G,Liu L,et al.SRF binding to SRE in the rat heart: influence of age[J].J Gerontol A Biol SciMed Sci,1998,53(1): B3-10.

[23]Zhang X,Azhar G,Chai J,et al.Cardiomyopathy in transgenic mice with cardiac-speci?c overexpres-sion of serum response factor[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2001,280（4）:H1782-H1792.

[24]Lu X G,Azhar G,Liu L,et al.SRF binding to SRE in the rat heart:influence of age[J].J Gerontol A Biol Sci Med Sci,1998, 53:B3-B10.

[25]Meyyappan,M,Wheaton K,Riabowol K T.De-creased expression and activity of the immediate-early growth response(E-gr-1)gene product during cellular senescence[J].J Cell Physiol,1999,179:29-39.

[26]Miano J M.Serum response factor:toggling between disparate programs of gene expression[J].J Mol Cell Cardiol,2003,35(6): 577-593.

[27]Sotiropoulos A,Gineitis D,Copeland J,et al.Signal-regulated activation of serum response factor is mediated by changes in actin dynamics[J].Cell,1999,98(2):159-169.

[28]Torrado M,Lopez E,Centeno A,et al.Myocardin mRNA is augmented in the failing myocardium:expression profiling in the porcine model and human dilated cardiomyopathy[J].J Mol Med, 2003,81(9):566-577.

[29]Sepulveda J L,Belaguli N,Nigam V,et al.GATA-4 and Nkx-2.5 coactivate Nkx-2 DNA binding targets:role for regulating early cardiac gene expression[J].MolCellBiol,1998,18(6):3405-3415.

[30]Wasserman WW,Palumbo M,ThompsonW,et al.Human/mouse genome com-parisons to locate regulatory sites[J].Nat Genet, 2000,26:225-228.

[31]Wiebel F F,Rennekampff V,Vintersten K,et al.Generation of mice carrying conditional knockout alleles for the transcription factor SRF[J].Genesis,2002,32:124-126.

2013-05-27）

（本文编辑：田云鹏）

311600 建德市第一人民医院心血管内科