泛素-蛋白酶体通路及其与胆道疾病相关性研究进展

杨建辉 鲁葆春

泛素-蛋白酶体通路及其与胆道疾病相关性研究进展

杨建辉 鲁葆春

泛素-蛋白酶体通路（UPP）是真核生物细胞质和细胞核内依赖于ATP、非溶酶体途径的蛋白质降解通路。UPP通路不仅能降解变性、异常或起短暂作用的蛋白质，而且能降解植物色素、转录因子、内膜蛋白和细胞周期蛋白等天然蛋白质，因而在转录水平调节、蛋白质降解、蛋白质稳定状态调节、程序性细胞死亡、细胞周期控制和免疫介导等过程中起重要作用，因此泛素介导的蛋白质降解通路的异常与许多疾病，如恶性肿瘤、脓毒血症所致肌肉萎缩等密切相关。笔者就UPP与胆道疾病相关性的研究进展作一综述。

1 UPP的组成

真核细胞主要有两种蛋白质降解通路，一种是溶酶体通路，主要降解经胞吞进入细胞的胞外蛋白质；另一种是非溶酶体通路，即UPP，主要经细胞内的蛋白酶体降解泛素化蛋白质。UPP主要由泛素（Ub）、泛素活化酶（E1）、泛素偶联酶（E2）、泛素连接酶（E3）、泛素链延长酶（E4）、去泛素化酶（DUB）、蛋白酶体等组成。

1.1 Ub Ub是真核细胞内一种由76个氨基酸组成的球形热稳定蛋白，分子量为8.45kD，其结构在真核细胞中高度保守，在不同生物体间组成Ub的氨基酸序列差别很小，如酵母和人的Ub仅有3个氨基酸序列的差别。因其在体内广泛存在、含量丰富而被称为Ub。Ub以自由形式和复合物形式两种存在，其功能位点为C2端的76位Gly残基和Lys残基，Gly残基上的羧基能与靶蛋白的Lys残基上的氨基形成异构肽键。另外，不同Ub分子的Gly残基与Lys残基之间结合，可形成一条长链[1]。Ub的功能主要是通过异构肽键结合胞浆内错误折叠或半衰期较短的蛋白，并以此指导蛋白酶体依赖的蛋白质降解。

1.2 Ub相关酶 蛋白的Ub化是由Ub相关酶启动的，是蛋白降解的关键步骤，是一种蛋白级联反应。E1水解ATP释放能量，使其半胱氨酸残基（Cys）的氨基与UbC2端的Gly的羧基形成高能硫酯键，从而激活Ub。而后活化的Ub（E1-Ub复合物）转酰基作用被转移到E2活性Cys上，并释放出E1，以新的高能硫酯键结合形成E2-Ub复合物。E2-Ub复合物可直接与特定的靶蛋白形成Ub-蛋白复合物。而在大多数情况下，需通过E3这个底物连接因子先与靶蛋白特异性结合，E2-Ub才获得与靶蛋白相互接近，继而靶蛋白与E2酶连接的Ub结合，从而完成靶蛋白的Ub化。在啤酒酵母菌研究中发现，Ub链延长酶E4，多个靶蛋白-E3复合物在其帮助下能连接形成长Ub链，称之为多聚Ub化修饰[2]。部分靶蛋白必须经多聚Ub化修饰后才能被蛋白酶体识别水解[3]。

细胞内同时存在去Ub化，是Ub化过程的逆转。Ub-靶蛋白偶联后，进入26S蛋白酶体内靶蛋白被降解，同时在特异性水解酶（去Ub化酶）的作用下能够解离Ub分子，可被重复利用。去Ub化酶主要有两大类：Ub羧基端水解酶（UCHs）和Ub特异性修饰酶（UBPs/USPs），均能催化水解Ub和底物蛋白之间的硫酯键，起到去Ub化作用，还能将错误识别的底物从Ub化复合体中释放出来，并重新释放出Ub分子。UCHs属于半胱氨酸蛋白酶，可以通过裂解UbC末端Gly将Ub分子从小的多肽底物上释放出来，也参与多聚Ub链产生Ub单体的过程。UBPs含有2个短而保守的片段，即Cys盒和Hi盒，能将Ub分子从大的蛋白上移除。两类酶都能参与去除和解聚底物蛋白质上的多聚Ub键，从而防止多聚Ub在底物蛋白的聚集，而以Lys48方式连接的多聚Ub链结构对去Ub化酶有对抗作用[4]。

1.3 蛋白酶体 蛋白酶体是Ub化蛋白的降解场所，存在于细胞核和细胞质内，主要发挥生物性效应是26S蛋白酶体。26S蛋白酶体包含1个20S核心蛋白酶和两个19S调控复合物，20S是具有蛋白酶体催化活性的核心颗粒，由4个并列环状中空圆柱状颗粒物构成，两端的颗粒物构成2个α环，中间的颗粒物构成2个β环。α环亚基负责靶蛋白的识别，而β环参与靶蛋白的降解，3个不同肽酶活性均位于β环的亚基上，分别为糜蛋白酶样、胰蛋白酶样和半胱氨酸蛋白酶样活性。进入26S蛋白酶体的蛋白质被多次切割，最后形成3～22个氨基酸残基的小肽。19S是具有调节功能的调节颗粒，由包含6个AAA-ATP酶的碱性亚复合体和包含8个非ATP酶的亚复合体组成，参与对靶蛋白的特异性识别。多聚Ub链形成后，可与蛋白酶体19S Ub受体相互作用，使靶蛋白去折叠进入26S蛋白酶体催化中心被降解。

2 Ub-蛋白酶体通路的功能

Ub和蛋白酶体分别是整个UPP的起始环节和核心位点，利用Ub化或去Ub化可以调控细胞内蛋白质水平并影响其功能。研究已证实，Ub介导了细胞内80%～90%的蛋白降解，参与了细胞周期循环、信号转导、炎症反应、DNA损伤修复、细胞凋亡及抗原递呈等许多生命过程。

细胞周期调控因子Ub化，然后由26S蛋白酶体降解，导致周期因子依赖的激酶失活，从而使细胞有丝分裂期中止。p53作为转录因子可以诱导细胞周期抑制因子和促凋亡基因的表达，当DNA受到损伤或发生不正常的细胞增殖时p53就会被激活，使细胞周期停止或使细胞发生凋亡。Anwar等[5]用蛋白酶体抑制物MG-132处理黑色瘤细胞，p53蛋白水平升高，半衰期延长，由此可见细胞中p53蛋白水平的调节主要是通过UPP通路来实现。

细胞信号转导通路中多种调节蛋白通过UPP活化和降解，控制着细胞的分化、生长、凋亡等过程，如UPP对核内转录因子NF-κB信号通路的调控。NF-κB是一多亚基组成的转录因子，其抑制因子IκB磷酸化后被26S蛋白酶体降解从而导致NF-κB以活性方式存在，相关的基因表达增强[6]。NF-κB可与IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α等细胞因子和炎性介质的基因启动子区域固定核苷酸序列结合，启动基因转录。

抗原分子Ub化后被26S蛋白酶体降解成多肽，然后由组织相容性复合体MHC I类分子提呈至细胞表面，应用蛋白酶体抑制剂可阻滞提呈至MHCⅠ类分子细胞表面多肽的产生。而脓毒症状态下的骨骼肌蛋白过度代谢亦是由UPP介导的。可见免疫、炎症反应、各种病理状态下的骨骼肌代谢等都与Ub-蛋白酶体通路有关。

3 Ub-蛋白酶体通路的调控

UPP降解许多蛋白，而这些蛋白带有某些能被Ub系统识别的信号，称作降解信号。有些天然蛋白，其降解信号被隐藏在疏水核心中，蛋白不被降解，但当蛋白结构变化出现部分解链区，降解信号就会暴露而被Ub系统发现并降解，这证实为何部分折叠、异常和突变蛋白易被降解的原因。有些氨基酸序列就是降解的信号，如转录因子Gcn4p，有281个氨基酸，91～106位氨基酸序列称为PEST序列，此蛋白正常的半衰期大约为5min，若将PEST序列移除，半衰期增加到50min。蛋白质N-末端氨基酸序列可预测它的半衰期，即N-末端规则，如蛋白质N-末端是天冬氨酸，半衰期为3min，若是丝氨酸，半衰期可长达20h。一旦多聚Ub化链接到蛋白上，蛋白必将运送到蛋白酶体，被展开然后降解，这些步骤依赖于降解信号或靶蛋白自身特性的调控。

UPP被特异性调控，主要是E3对靶蛋白序列或降解信号来特异性地识别和降解，决定反应的特异性。根据识别靶蛋白序列中结构域不同，E3分为两类：（1）HECT型E3连接酶，结构域上的半胱氨酸残基与E2携带的Ub以硫酯键连接形成复合物Ub-E3，再将Ub转移到靶蛋白上[7]。（2）RING-finger E3连接酶，包含一个RING-finger结构域，可以与Ub-E2形成复合体，但其本身不与Ub发生作用，不能以硫酯键直接与Ub结合，只是将Ub转移给靶蛋白[8]。

4 Ub-蛋白酶体通路与胆道疾病的关系

4.1 UPP与胆道感染 急性重症胆管炎（ACST）是在胆道完全梗阻的基础上发生的一种严重的急性胆道感染，存在着细菌易位和肠源性内毒素血症。占全身单核巨噬细胞系统85%～90%的肝枯否细胞（KCs）是胆血屏障的重要组成部分，是清除来自胆道和肠道内细菌及其内毒素的主要场所。

ACST时，动物血循环中内毒素（LPS）水平显著增加，KCs吞噬能力受到严重损害。而胆道梗阻后血循环中的脂多糖结合蛋白（LBP）水平也显著提高[9]。LPSLBP复合物形成后，与KCs表面脂多糖受体CD14借助于糖基磷脂酸肌醇相结合并将LPS的刺激信号传递细胞内，激活KCs胞浆内的NF-κB核转录因子。在静息状态下，NF-κB存在于胞质内并与抑制因子（IκB）结合形成无活性的三聚体复合物。ACST时，当LPS的刺激信号传人细胞内后激活NF-κB诱导激酶，使IκB磷酸化，通过UPP被26S蛋白酶体降解，从而使NF-κB活化，并露出其核定位信号，特异性结合在DNA序列上，引起许多因子的转录，包括促炎因子IL-1β、IL-6等。Gong等[10]的研究表明，ACST患者外周血单核细胞内NF-κB活性明显增强，其增强的程度与胆道感染的程度密切相关，并与患者的预后相关。

ACST时，脓毒症发生率为100%，伴有严重的代谢性酸中毒，且常伴发1个或多个脏器的功能障碍。研究表明，脓毒症时骨骼肌蛋白的降解是由于Ub-蛋白酶体途径被激活的。内毒素、TNF-α等介质是直接或间接导致骨骼肌蛋白降解的重要诱导或调节因子，抑制炎症介质NF-κB途径可有效降低严重脓毒症状态下的骨骼肌蛋白降解率[11]。Mutsvangwa等[12]建立奶牛酸中毒模型研究酸性代谢中肌蛋白降解增加的机制，发现ATP参与了其反应过程，而溶酶体和钙离子激活酶则未参与，酸中毒大鼠骨骼肌组织中UbmRNA量增加了25%、E2mRNA量增加了34%，蛋白酶体C8亚基mRNA增加了20%，从而进一步证实UPP上调是酸中毒时骨骼肌流失的蛋白质增加内在机制。

4.2 UPP与胆道梗阻 急慢性胆道梗阻可引起胆汁性肝硬变，可伴随机体负氮平衡，体重的减轻。Lin等[13]将成年雄性大鼠胆道结扎诱导胆汁性肝硬变，发现胆道结扎大鼠的肌肉蛋白降解率增高，Ub、Ub载体蛋白E2、蛋白酶体亚基C8和C2的基因表达增强，肌肉蛋白中游离Ub和结合Ub的水平均升高，而其中TNF-α在整个机制中起到了重要作用。Wang等[14]的研究表明，胆道结扎诱导胆汁性肝硬变大鼠，骨骼肌蛋白硝化、Ub化明显加强，注射左旋-硝基精氨酸甲脂治疗后骨骼肌Ub化水平明显下降。在原发性胆汁性肝硬变患者研究中，免疫组化染色提示胆管上皮细胞Ub明显提高，熊去氧胆酸可减少其表达[15]。

4.3 UPP与胆道肿瘤 E3为Ub蛋白酶体降解途径中的关键酶，能特异性识别底物蛋白并使其Ub化，RING-finger E3连接酶以cullins蛋白作为模板装配而成，cullin家族已发现有cul-1、cul-2、cul-3、cul4A、cul4B、cul-5和cul-7等7个成员；cul-1作为cullins蛋白代表性成员，其组装的复合体具有典型的Ub连接酶活性。新近研究证实，cu1-1介导许多细胞相关的功能蛋白的降解过程，有效地调节着细胞周期进程，其异常改变可能在恶性肿瘤发生、发展中有极重要作用。刘栋才等[16]的研究表明，胆囊腺癌Ub和cul-1表达阳性率分别为51.9%和48.1%，明显高于癌旁组织、腺瘤性息肉、慢性胆囊炎胆囊上皮，胆囊腺癌中Ub表达水平与cul-1表达水平呈高度一致性。刘燕雷等[17]采用免疫组织化学法结合蛋白印迹技术检测人胆道肿瘤组织、正常胆道组织及炎性组织中Ub蛋白的表达，发现胆道肿瘤组织中Ub蛋白的表达显著高于正常组织及炎性组织中Ub蛋白的表达，表明Ub蛋白在人胆道肿瘤组织中表达水平升高，可能与胆道系统肿瘤的恶性程度、疾病的进程密切相关。

USP14属于Ub特异性蛋白酶家族，Chuensumran等[18]采用实时定量PCR方法研究发现，在胆管细胞癌患者肿瘤组织中USP14基因表达明显上调，其表达水平与肿瘤临床病理特征、组织学分级相关，与病理分期、淋巴结转移等无明显相关。人突变基因p27表达蛋白是一种热稳定蛋白，主要抑制细胞周期因子E-CDK2复合体的活性，同时也能抑制细胞周期因子D-CDK4和细胞周期因子A-DK2复合体，还能下调细胞周期因子B的表达。p27蛋白的降解主要由受Ub介导的第187位苏氨酸磷酸化引起的。Sasaki等[19]采用腺病毒诱导野生型 p27kip1突变，基因片段由 Thr-187/Pro-188（ACGCCC）转为Met-187/Ile-188（ATGATC），然后转染胆管癌细胞系TFK-1和HuCCT-1，引起表达p27 kip1蛋白的UPP降解通路受阻，p27 kip1蛋白大量堆积导致细胞在G0/G1期停留，从而促进肿瘤细胞凋亡及明显抑制肿瘤细胞增殖。

5 结语

UPP是高效、广泛、有选择性的蛋白质降解途径，参与细胞周期调节、信号转导、转录调控、免疫应答等各种细胞生物学功能，其改变与胆道疾病的发生、发展及治疗密切相关，是研究胆道疾病的一个新靶点。胰岛素在ACST脓毒症状态下具有直接调节免疫炎症反应的作用，减少炎症介质分泌，抑制骨骼肌蛋白质降解，其调节机制证实通过对UPP的研究而被了解。胆管肿瘤起病隐匿，预后差，UPP的研究对于阐明发病机制、推动早期诊断及开发分子靶向治疗提供了新思路和新策略。

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2013-02-06）

（本文编辑：欧阳卿）

浙江省公益性技术应用研究计划项目（2011C33023）

312000 绍兴市人民医院普外科（肝胆外科）

鲁葆春，E-mail：lbc111@yeah.net