乳腺癌的DNA甲基化研究进展

林俊 金洪传

●综 述

乳腺癌的DNA甲基化研究进展

林俊 金洪传

乳腺癌是严重威胁女性健康的疾病，其发病机制还不是很清楚。随着研究手段的不断提高，目前发现乳腺癌的发病机制不仅仅局限于基因突变、缺失等遗传学变化[1]。随着表观遗传学的理论研究的深入，DNA甲基化在乳腺癌的病理生理过程中的作用逐渐被揭示。DNA甲基化是指经过DNA甲基转移酶的催化，将由S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基添加到DNA的某些碱基上，在哺乳动物细胞中主要是鸟嘌呤前的胞嘧啶（即CpG中的C）上。作为基因表达的重要调控方式，DNA甲基化参与胚胎的生长发育等生理活动，并与肿瘤发生、发展等病理过程密切相关[2-3]。DNA甲基化调控基因表达的方式主要包括抑制转录因子及其协作因子与基因启动子间的相互作用，抑制转录因子以及DNA依赖的RNA聚合酶活性等。DNA的甲基化状态可以由亲代细胞传给子代，因此是表观遗传学研究的主要内容之一。启动子区DNA的甲基化可导致重要抑癌基因的表达下降，从而促进乳腺癌的发展[4-5]。笔者就乳腺癌中DNA甲基化的研究进展作一综述。

1 乳腺癌相关基因的DNA甲基化

1.1 BRCA1 BRCA1是一种在正常乳腺及卵巢组织中高表达的抑癌基因，在乳腺癌等肿瘤中往往因为突变和杂合缺失导致其功能缺失。近年来发现在散发性乳腺癌的患者中存在BRCA1启动子区DNA的甲基化[6-8]。研究显示11%的浸润性乳腺癌患者中BRCA1基因表达水平很低或者缺失，同时也发现其启动子区DNA处于高甲基化状态，因此BRCA1基因可能因为DNA甲基化而表达沉默，从而失去了对乳腺癌细胞的生长抑制作用，最终导致了癌症的发生[9]。在髓样癌和黏液腺癌的发生过程中，BRCA1基因的甲基化也发挥了重要作用。组织学分级高、分化程度低和有淋巴转移的散发性乳腺癌患者中BRCA1甲基化程度更高，提示BRCA1甲基化在乳腺癌的进展过程中也有一定的作用。

1.2 细胞周期依赖性激酶抑制基因（CDKN2A）/p16 p16是一种细胞周期蛋白酶抑制因子，其编码基因CDKN2A也是一种常见的抑癌基因。p16与细胞周期蛋白竞争和CDK4、CDK6的结合位点，使细胞周期在G1/S期发生阻滞，从而导致细胞增殖能力下降。在很多肿瘤如乳腺癌、肝癌、肺癌等中都出现了CDKN2A基因的甲基化[10-12]。有报道显示CDKN2A基因在乳腺癌患者中的甲基化率为28.2%,而在良性乳腺疾病患者中却未发现CDKN2A基因的甲基化；而且恶性程度高或者伴发转移的乳腺癌患者中CDKN2A基因的甲基化程度更高，因此CDKN2A的甲基化对乳腺癌的发生、发展具有一定的促进作用[10]。

1.3 脆性组氨酸三联体基因（FHIT） FHIT基因位于人类染色体3p14.2，包含10个外显子，编码区cDNA全长约1.1kb，编码的蛋白质具147个氨基酸，分子量为16.8kDa。FHIT蛋白是一种DNA损伤修复蛋白，参与细胞周期调控等重要生命活动[13]。在正常组织中FHIT基因广泛表达，而31%的原发性乳腺癌患者出现了此基因的甲基化，特别是在散发性乳腺导管癌患者中67%的FHIT基因表达发生了变化，而这种变化与该基因启动子区DNA高甲基化密切相关[14-15]。

1.4 雌激素受体（ER） ER与很多基因的表达有关，参与多种生命活动并与乳腺癌发病过程密切相关[16]。＞2/3的乳腺癌患者具有ER基因高表达现象，但这些患者的乳腺癌细胞往往增殖能力差，发展缓慢，患者生存期比较长，也有部分患者在乳腺癌的进展过程中ER转变为阴性。大约1/3乳腺癌患者ER表达缺失，ER表达缺失的乳腺癌患者癌细胞增殖较快，疾病恶性程度较高，预后较差[17-18]。目前尚无证据证明ER表达的缺失是由突变造成的，相反有证据提示ER阳性的乳腺癌细胞系和正常乳腺细胞中不存在ER基因的甲基化，而ER阴性乳腺癌细胞系及原发性乳腺癌患者癌细胞中ER基因的甲基化发生率却很高。应用5-氮-脱氧胞嘧啶等DNA甲基化抑制剂抑制DNA甲基化即可检测到ER的表达水平显著升高。

1.5 基质金属蛋白酶组织抑制剂-3（TIMP-3） TIMP-3通过抑制基质金属蛋白酶的活性，从而控制肿瘤细胞增殖和迁移[19]。在乳腺癌细胞中检测到TIMP-3甲基化，而在正常组织中不发生甲基化，而且该基因的甲基化程度与乳腺癌的恶性程度呈正相关[20]。

1.6 MDGIMDGI基因编码蛋白的主要功能是促进乳腺上皮细胞分化为乳腺小泡，分泌乳汁。MDGI基因也因为DNA的甲基化而在乳腺癌组织中低表达[21]。

1.7 共济失调毛细血管扩张症突变基因（ATM） ATM被认为是继BRCA1之后与乳腺癌的发病相关性较高的基因，对细胞周期起到重要的调控作用。其编码产物作为一种细胞周期关卡蛋白，保证在细胞分裂过程中细胞周期的一个阶段完全结束后再开始下一个阶段。而在肿瘤细胞中经常存在关卡蛋白的缺失，DNA复制速度增加，细胞增殖能力提高。有报道在晚期乳腺癌患者细胞中检测到了ATM的甲基化，而且其表达水平与甲基化状态有关[22-23]。

1.8 RAS相关区域家族1A基因（RASSF1A） 作为候选抑癌基因，RASSF1A基因在正常组织中广泛表达，而在已报道的多种恶性肿瘤中,呈明显的低水平表达或表达缺失[24]。关于该基因表达异常的原因，目前研究倾向于与基因启动子发生了高甲基化有关。在散发性乳腺癌患者的癌组织中，33.3%RASSF1A基因表达缺失，其余有不同程度低表达，而癌旁组织和良性乳腺肿瘤组织中RASSF1A基因均有表达，故研究者推测RASSF1A蛋白可能参与阻断RAS激活的信号途径或抑制内源性Cyclin-D1、Cyclin-D3的积累，使细胞周期阻断在G1/S期，从而抑制恶性细胞增殖[25]。

2 乳腺癌相关基因DNA甲基化的临床意义

有研究证实，约30%的乳腺肿瘤患者中ER基因表达缺乏同时表现出对内分泌治疗的耐受，而ER的表达缺乏与基因启动子甲基化相关，这就说明ER基因启动子的甲基化状态能够一定程度上预示患者对内分泌治疗的反应性。同样，乳腺癌患者血清中RASSF1A基因的过甲基化状态能够预示患者对他莫西芬治疗的耐受。近年来人们又发现，淋巴结转移以及ER均阳性的乳腺癌患者在蒽环类药物辅助化疗后，其CDO1基因启动子DNA的甲基化情况可作为治疗后转移情况的预测指标[26]。

3 DNA甲基化在乳腺癌相关肿瘤标志物开发中的价值

因DNA甲基化而表达下调的乳腺癌相关抑癌基因发生去甲基化后，其表达以及抑癌功能就可以恢复，因此可以抑制乳腺癌进展。在临床上，包括5-氮-脱氧胞嘧啶在内的一系列非特异性的抑制剂均能够通过改变抑癌基因的甲基化程度来发挥乳腺癌治疗作用。作为胞苷类似物，5-氮-脱氧胞嘧啶抑制DNA甲基化的主要原理是可掺入DNA并抑制甲基转移酶（DNMT）催化的DNA甲基化。小剂量5-氮-脱氧胞嘧啶可作用于细胞分裂过程，持续规律给药后可实现癌细胞最大程度上的去甲基化[27]。需注意的是，5-氮-脱氧胞嘧啶在去甲基作用时会导致骨髓抑制的不良反应，而且半衰期较短，致使药效持续时间短。为克服这些缺点，目前正在研制一种新型的抗肿瘤药物zebularine。研究发现zebularine能够使7种人类肿瘤细胞系中25%～60%甲基化基因去甲基化[28]，而且具有很好的稳定性及很低的细胞毒性，在临床上可以实现口服和腹膜内注射两种方式给药。

目前很多抑制甲基化的生物制剂应用于临床和食品添加剂，比如普鲁卡因胺、没食子酸盐（EGCG）。这些物质去甲基功能的发现对癌症的早期预防起到了一定的效果，但临床应用还需要进一步的研究和验证。研究中人们还发现地西他滨能够激活沉默的肿瘤抑制因子，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（LAQ824）能够激活已经停止分裂的细胞的细胞周期[29]，因此在临床上可将这些药物与小剂量5-氮-脱氧胞嘧啶核苷联合应用以产生更好的抗肿瘤效果。例如低剂量的5-氮-脱氧胞嘧啶核苷联合曲古菌素A（TSA）就能够促进ER阴性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞中的ER重新表达。因此抑制乳腺癌相关基因DNA甲基化的治疗往往可以选择联合用药，以实现疗效的最优化。

4 小结

对乳腺癌相关基因DNA甲基化的多角度多层次研究使人们对乳腺癌的诊断、治疗甚至是对转归和预后有了更深层次的认识。虽然DNA甲基化与肿瘤发生有高度的一致性，目前尚没有明确的证据证明这两者的相关性，故对于乳腺癌细胞中DNA甲基化的病理生理机制还需要进一步深入的研究[30]。目前临床对于抑制肿瘤甲基化方面的治疗并不成熟，大多数药物在疗效、给药途径及不良反应方面还存在很大缺陷。为此，需要进一步深入研究寻找更好的的DNA甲基化诊断方法，研制出更高效低毒的去甲基化药物，来实现对乳腺癌患者的早期诊断和有效治疗。

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2013-06-18）

（本文编辑：胥昀）

卫生部浙江省共建项目（N20120542）

310016 杭州，浙江大学医学院附属邵逸夫医院临床医学研究所（林俊系硕士研究生，现在建德市第二人民院肿瘤科工作）

金洪传，E-mail:jinhc@zju.edu.cn