真皮间充质干细胞成骨分化的研究进展

王庭亮 综述 祝 联 审校

真皮间充质干细胞成骨分化的研究进展

王庭亮 综述 祝 联 审校

骨组织工程技术修复骨组织的缺损显示了广阔的应用前景。真皮间充质干细胞 （Dermal mesenchymal stem cells，DMSCs）来源于皮肤组织，易大量获取，对供区损伤极小，具有包括成骨分化在内的多向分化潜能，有望成为骨组织工程研究合适的种子细胞。我们就真皮间充质干细胞成骨分化的研究进展进行综述。

真皮间充质干细胞 成骨分化 骨组织工程

因创伤、肿瘤或疾病等各种原因造成的骨缺损，目前一般通过自体骨移植或同种异体骨移植的方法进行修复。但是，自体骨移植对供区损伤大，采骨量有限，难以修复大块的骨缺损；同种异体骨来源于骨组织库，骨组织库是按一定标准和技术选择供体，收集、加工、灭菌、检验、贮存和发放骨组织的机构[1]。骨库来源骨在治疗骨缺损中的疗效已经得到广泛认可，但是异体骨的来源无法得到保障，难以应对日益加剧的临床需求。

骨组织工程技术修复骨缺损已经显示了广阔的应用前景。目前的骨组织工程研究多以骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）和脂肪间充质干细胞（Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）作为种子细胞。BMSCs分化能力强，成骨效果确切，但是骨髓组织获取的量较少，对供者损伤较大。ADSCs同样具有成骨潜能，可以通过吸脂手术大量获得，但获得的细胞群体组成复杂，分离纯化难度较大，且个体差异很大。

真皮间充质干细胞（Dermal mesenchymal stem cells，DMSCs）来源于皮肤组织，易大量获取，对供体损伤极小。研究表明，DMSCs具有包括成骨分化在内的多向分化潜能[2-5]，有望成为骨组织工程研究合适的种子细胞。

DMSCs曾被认为是有多向分化潜能的真皮成纤维细胞亚群[4-7]。但其特性符合国际细胞治疗协会推荐的间充质干细胞界定标准，所以将其命名为DMSCs[2，8-9]。

1 真皮间充质干细胞生物学特征

1.1 真皮间充质干细胞的分离与培养

Toma等[10]于2001年首次从小鼠真皮中分离得到一种细胞，将其命名为皮肤前体细胞 （Skin-derived precursors，SKPs）。SKPs与Pittenger等[11]描述的成体间充质干细胞（Adult mesenchymal stem cells，MSCs）特性截然不同，是一种能向神经细胞和中胚层分化的多能非间充质干细胞。Kawase等[12]重复并验证了Toma等的工作，并进一步证实转化生长因子β（TGF-β）能促进SKPs的生长，但是TGF-β对神经干细胞并没有促进生长的作用，表明SKPs与神经干细胞并不相同。Toma等[13]于2005年证实，在人真皮中同样存在SKPs。这些研究提示了真皮中可能含有复杂的成体干细胞群体。

Bartsch等[2]于 2005年，首次对DMSCs的增殖、体外扩增、多向分化能力进行了详细的研究。证实DMSCs具有分化为骨细胞、脂肪细胞、肌细胞的潜能，并根据 DMSCs单细胞克隆均保留三向分化潜能，认为DMSCs是由单一细胞系组成。陈付国等[5]对DMSCs分化成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞的三向分化能力进行了阐述，并进行单细胞克隆研究，发现有单向分化、双向分化和三向分化等不同水平分化潜能细胞存在，认为DMSCs可能是复杂的干细胞群体。

1.2 DMSCs干细胞特征鉴定

1.2.1 DMSCs的自我更新能力

自我更新能力是鉴定干细胞的重要标准之一。干细胞通过不对称分裂产生子代干细胞和非干细胞成分，子代干细胞维持其复制能力，非干细胞成分则继续分化。研究发现，DMSCs经100次以上倍增，仍能保留染色体的完整性和多向分化潜能[2]。陈付国等[5]的实验显示，体外传代至15代的DMSCs的扩增能力未见减弱，到达对数倍增期的时间也无显著改变。另一项对比研究提示，DMSCs的倍增时间短于BMSCs和ADSCs[14]。

1.2.2 DMSCs的多向分化潜能

DMSCs具有向中胚层三大分化方向（骨、脂肪、软骨）分化的能力。通过单细胞克隆诱导分化，Bartsch等[2]发现单克隆的细胞系均有三向分化能力；陈付国等[4]则发现有单向分化、双向分化及三向分化等不同水平分化潜能细胞存在，认为Bartsch等获得的单一细胞系只是细胞群中的一种。但是，Pittenger等[11]在BMSCs诱导分化过程中发现，部分克隆表现出有限的分化能力时，克隆细胞的分裂增殖次数增加，体外培养环境等因素均可能导致这些细胞本来存在的多向分化潜能的丢失。Manini等[15]亦观察到ADSCs在培养过程中，容易丢失成脂分化能力，但仍保留成骨分化能力，这在某种意义上证实了Pittenger等的推测。由此可以认为，陈付国等发现有不同分化水平的间充质干细胞存在，可能只是培养过程中分化潜能丢失的表现。因此，DMSCs是单一细胞系还是多细胞系，尚需进一步的研究加以证实。

1.2.3 DMSCs表面标志物

Bartsch等[2]对DMSCs进行流式细胞分析显示，DMSCs表达CD90和 CD105，同时表达中胚层细胞标志 SSEA-4。SSEA-4是一种胚胎早期的糖酯抗原，通常作为未分化的多能胚胎干细胞和囊胚期卵裂胚胎干细胞的表面标志物，可用于鉴定筛选BMSCs[16]，但是用于DMSCs的筛选尚未见报道。陈付国等[4]研究显示，DMSCs表达的表面标志有 CD13、CD29、CD49d、CD105和Stro-1等；低或不表达CD34、CD45、CD106和CD133等。Lorenz等[6]的实验显示，阳性表达CD44、CD71、CD73、CD90、CD105和CD166；CD14、CD31、CD34、CD45和CD133为阴性。Orciani等[17]的结果表明，HLA-A、B、C和CD29、CD44、CD73以及CD90为强阳性，CD105为弱阳性，CD10、CD11b、CD14、CD34、CD49d和HLA-DR为阴性。其中CD34和CD45是造血细胞特异性表面标志物。上述结果均表明，DMSCs不表达CD34和CD45，提示了DMSCs与造血系细胞的不同；而CD44、CD73、CD90和CD105是间充质干细胞相对特异性的表面标志物，均在上述一系列实验中呈现阳性表达。然而，目前的研究尚未发现DMSCs特异性的表面标志物。值得注意的是，上面的结果与ADSCs表面标志物的表达非常相似[18]。

2 真皮间充质干细胞成骨分化

2.1 DMSCs成骨亚群的分离与纯化

从皮肤组织中获得的DMSCs混杂有大量的其他细胞，另外DMSCs本身也可能是不同分化潜能细胞组成的群体。因此，分离与纯化DMSCs具有重要的实际应用价值。陈付国等[5]最早对DMSCs的分离纯化进行了探索，但实验显示，CD105+细胞并未表现出明显的增殖和分化优势。此后，有研究尝试对不同分化潜能的DMSCs进行差异膜蛋白分析，试图找到合适的表面标志物以分离具有不同潜能的DMSCs，但未获得期待的结果[19]。通过研究其他表面标志物，如CD13、CD44、CD54、CD271等，试图对DMSCs进行分离纯化也未获成功[7，17，20]。He等[14]利用细胞表面骨形成蛋白 I型受体 B亚型（Bone morphogenetic protein receptor IB，BMPR-IB）对DMSCs进行分离纯化，得到BMPRIB+和BMPRIB-两群细胞，结果显示前者的增殖和成骨分化潜能明显优于后者，且前者成骨分化能力与BMSCs相近,表明BMPR-IB可能就是特异性的表面标志物。相关研究已对BMPR-IB在成骨分化中的作用进行了初步探讨[21]，但是其机制还需更深入的研究。

2.2 DMSCs成骨分化诱导

2.2.1 生物化学诱导因素

研究显示，DMSCs同其他成体间充质干细胞一样，不能够自行分化为骨细胞，需要外源性诱导分化介质[2，5]。体外成骨诱导介质主要由地塞米松、β磷酸甘油、维生素C组成。地塞米松能增加碱性磷酸酶（ALP）活性和BMP-6基因表达，但持续存在的这些分化促进剂能够诱导一些间充质干细胞群体的凋亡[22]；皮质类固醇激素在体内能造成骨质疏松等不利于成骨的影响。因此，成骨诱导介质的改进一直是研究的热点。Hee等[23]发现，1α,25-二羟维生素D3是强有力的诱导成骨分化剂，在DMSCs诱导成骨分化中，维生素D3诱导组产生的ALP活性高于地塞米松组，也高于这两者共同诱导组，但是在BMSCs中，必须存在地塞米松才能诱导成骨分化。Chevallier等[22]的研究表明，血小板溶解物培养的间充质干细胞（不添加其他成骨诱导介质）在体外能够自发地诱导成骨基因（如ALP、BSP、OP、BMP-2）的表达，加强成骨分化，并且种植于陶瓷支架上能够在体内异位成骨。

2.2.2 物理机械诱导因素

物理机械因素对体内骨的形成、保持和更新均有重大影响。Sommar等[24]证实，体外流体剪切力有一定的独立成骨诱导能力，能够加强DMSCs的成骨分化。Pre等[25]发现，低振幅的高频振动可加强ADSCs的成骨分化，并缩短成骨分化时间，并可在无成骨诱导介质时单独诱导成骨分化。Delaine-Smith等[26]认为，调控体内骨的数量、结构和强度的机械力量主要是振荡的流体剪切力，他们将化学成骨诱导介质和振荡的流体剪切力两者结合，观察对DMSCs成骨分化的影响，发现I型胶原分泌增加，胶原结构改变，ALP活性增强，矿物质沉积增加等现象。以上研究表明，物理机械因素可能是通过影响细胞骨架结构，改变细胞外基质结构（如胶原结构）的途径产生某些信号分子或激活某些信号通路，增强其成骨分化能力。

2.2.3 细胞间相互作用

血管生成与成骨是密切相关的，微血管内皮细胞和成骨细胞的相互作用在骨再生过程中极为重要。Laranjeira等[27]将微血管内皮细胞与间充质干细胞按4∶1的比例共培养，结果显示，ALP、Ⅰ型胶原、RUNX2基因表达和细胞外矿物质沉积均明显优于单纯的间充质干细胞培养，增强了成骨分化；同时，内皮细胞的血管生成基因表达也增强了。细胞共培养体系模拟体内细胞相互作用过程，对骨组织工程体外构建有重要意义，同时有利于保持细胞增殖和分化潜能。

2.3 DMSCs构建骨组织的研究进展

目前，DMSCs作为种子细胞构建骨组织已有了良好的进展。Kang等[9]将猪DMSCs在去矿物质骨和纤维蛋白凝胶支架上共培养，结果表明，去矿物质骨和纤维蛋白凝胶支架复合DMSCs能进行自体骨移植。Sommar等[24]在体外将人DMSCs置于三维大孔径明胶微载体中培养，并使用流体剪切力进行诱导，显示出良好的成骨潜能。

3DMSCs与BMSCs、ADSCs成骨分化能力的比较

何金光等[28]通过对人DMSCs、BMSCs、ADSCs的对比研究发现，在定量条件下，DMSCs向成骨细胞分化的能力要弱于ADSCs和BMSCs,认为未经分离纯化的DMSCs并不适合作为骨组织工程的种子细胞。但是，通过BMPR-IB分离和纯化得到的BMPRIB+细胞群成骨分化能力与BMSCs相近，表现出作为骨组织工程种子细胞的可能性。

4 应用前景

采用组织工程技术构建骨组织，进行用于骨缺损的修复，合适的种子细胞是研究的重点。有研究显示，DMSCs在体外不刺激T细胞增殖，在体内不引起免疫排斥反应[29-32]。虽然DMSCs的临床应用还有很多亟待解决的问题，但是作为一种新的种子细胞，DMSCs在骨组织工程乃至整个再生医学领域可能拥有广阔的研究及应用前景。

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Osteogenic Differentiation of Dermal Mesenchymal Stem Cells

WANG Tingliang,ZHU Lian.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHU Lian(zhulian6@hotmail.com).

Dermal mesenchymal stem cells;Osteogenic differentiation;Bone tissue engineering

Q813.1+2

B

1673－0364（2013）01－0047－04

2012年10月20日；

2012年11月29日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.01.015

200011 上海市 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

祝联（E-mail：zhulian6@hotmail.com）。

【Summary】Tissue engineered bone showed broad prospects in bone transplantation.Dermal mesenchymal stem cells derived from skin tissue are easy to obtain large volumes,have minimal damages to the donor,have the ability of multipotential differentiation including osteogenic differentiation,and are expected to become the most appropriate seed cells in bone tissue engineering.In this paper,the research progress of osteogenic differentiation in dermal bone mesenchymal stem cells is reviewed.