氧预处理的BMSCs联合支架材料修复骨缺损的研究进展

李庆伟 张 聪 综述 孟纯阳 审校

·综述·

氧预处理的BMSCs联合支架材料修复骨缺损的研究进展

李庆伟 张 聪 综述 孟纯阳 审校

骨髓间充质干细胞在一定的条件下可以分化为具有特定功能的细胞系，作为种子细胞参与骨缺损的修复，显示了良好的应用前景。氧预处理是种子细胞在种植到支架材料前，为改善细胞生存和适应能力所采取的措施，旨在减少或防止种子细胞丢失。本文就经过氧预处理的骨髓间充质干细胞联合支架材料修复骨缺损的研究进展进行综述。

骨缺损 预处理 高压氧 支架材料

组织工程技术在骨缺损修复领域已得到广泛的关注，骨髓间充质干细胞（BMSC）作为种子细胞参与骨缺损的修复，显示了良好的应用前景。大量研究表明，不同的细胞微环境对BMSCs的增殖、分化会产生影响，进而影响修复的效果。低氧浓度对BMSC的增殖有明显的促进作用，但对于分化作用仍存在分歧。另外，用于骨缺损修复的生物材料种类繁多，不同的材料对治疗效果也有非常重要的影响。本文就不同氧浓度处理BMSC联合支架材料，经高压氧修复骨缺损的研究进展进行综述。

1 BMSC的来源、功能和成骨调节机制

BMSC是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的一种干细胞，在骨髓组织中最为丰富。研究显示，间充质干细胞可以在不同条件下分化为所有中胚层来源的组织，如成骨细胞、软骨细胞等，已成为最具潜力的骨组织工程种子细胞[1]。

体外培养时，BMSC需要依赖成骨诱导作用才能向成骨方向分化。刺激MSCs成骨细胞分化的调节因子有很多。包括①骨形态发生蛋白2（Bone morphogenesis protein 2，BMP-2），被认为是使间充质干细胞向成骨细胞分化的最初信号分子，是一组低分子量肽类物质，通过BMP-2受体、靶基因和信号途径，组成完整的信号系统发挥骨诱导作用。BMP-2处于系统的核心和启动位点[2]。BMP是强有力的诱导因子之一，体内实验表明，新骨的形成量与BMP的表达量呈正相关[3]。②成纤维细胞生长因子（FGF），在BMSC增殖中有着重要作用。③地塞米松 （DXM），作为糖皮质激素可以促进其成骨细胞分化。早期以促进基质合成为主，晚期以促进矿化为主。④转化生长因子-β（TGF-β），可增强细胞分裂、增殖，促进成骨细胞产生，同时还具有抑制干细胞向脂肪细胞分化的作用。除此之外，β-甘油磷酸钠（β-GP）、维生素 C（VitC）等也能促进MSCs向成骨细胞分化。但是上述生长因子成本高昂，整个分离、培养过程技术较为复杂，离真正的临床应用还有较大距离。今后应在生长因子的替代研究和培养技术的简便化方面进行更为深入的研究，使之能够真正地应用于临床患者。

2 不同氧浓度处理对BMSC增殖、分化的影响

BMSC作为骨组织工程的种子细胞，高效获取、大量扩增等仍然是亟待解决的问题。研究发现，干细胞体外增殖分化通常是在20%氧的条件下，而体内动脉血氧浓度约12%，组织的平均氧浓度约3%，骨髓的氧浓度为l%～7%，富集干细胞的胚体氧浓度更低，而且处于一种动态变化中。Bosch等[4]分离培养猪来源的MSCs，发现其在低氧条件下增殖能力增强。大量文献显示，低氧促进MSCs扩增并抑制分化[5-7]。

研究显示，低氧环境有利于MSCs的增殖。D'Ippolito等[8]将成体骨髓多向诱导细胞（Marrow-isolated adult multilineage inducible，MIAMI）置于不同氧浓度（1%，3%，5%，10%，21%）的环境中培养扩增，发现在3%氧浓度下培养3 d的细胞总数，比在21%氧浓度下培养7 d的还要多3倍，据此推测，低氧微环境有利于促进骨髓干细胞的自我更新和增殖。其他研究也发现，低氧环境能够促进MSCs集落增殖，同样复氧过程对MSCs增殖的抑制作用也证实了这一点[9-10]。Lennon等[7]研究发现，低氧环境可以使鼠MSCs成骨能力增强。这些差异可能跟细胞的来源有关，用于研究的MSCs包括鼠源或人源，骨髓来源或脂肪来源等，不同来源的细胞对氧的适应能力可能存在差异[11]。 Moussavi等[12]研究表明，MSCs在体内处于低氧环境中，因而对高氧应激敏感，在2l%氧浓度下培养的细胞比5%氧浓度下培养的细胞产生更多的氧化产物，对生长不利。

高浓度的乳酸可影响细胞的代谢，抑制MSCs生长[13]。因此，低氧条件下大规模扩增MSCs时，应注意培养液中乳酸的浓度，防止高浓度乳酸对细胞生长产生抑制作用。

不同氧浓度对BMSC分化的影响，目前尚存在争议。在同样的成骨诱导过程中，5%氧浓度下MSCs产生的矿化物质与在20%氧浓度中产生的相比，少了近50%；当将在5%氧浓度中的MSCs转移至20%氧浓度中诱导分化时，矿化物质的产生量达到了20%氧浓度组的水平[14]。Fehrer等[9]将MSCs置于不同氧浓度中进行诱导分化，运用qPCR分析MSCs向脂肪细胞或成骨细胞的分化情况，结果显示，低氧浓度中的MSCs向脂肪细胞或成骨细胞分化的能力明显减弱。D'Ippolito等[8]同样检测到高氧组中成骨细胞标志物的表达要明显高于低氧组。暴露于低氧环境中时间的长短，都将成为MSCs成骨分化的影响因素。

大量研究表明，氧浓度微环境对骨髓间充质干细胞的增殖和分化都具有重要的调节作用，但由于细胞来源、诱导方向、诱导条件等多种不确定因素，氧浓度对MSCs分化的影响尚缺乏定论，有待于进一步的探讨和研究。

3 支架材料的研究

在骨组织工程的研究中，支架材料的选择也是相当重要的环节，不仅影响着新骨的形成，而且关系到骨缺损处承受负荷的能力[15]。

3.1 羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）

HA是人类骨组织中主要的无机矿物质，本身并不具有成骨能力，在骨形成过程中起中心支架作用。但存在脆性较大、较难切割等缺点[16]。

3.2 纳米羟基磷灰石（nano-HA）

nano-HA更好地模拟了天然的骨组织结构，支持植入细胞的黏附、增殖和分化，可有效促进新骨形成[17]。Zhu等[18]用孔径为50~150 μm、100~250 μm和300~500 μm的nano-HA参与兔骨缺损的修复，发现孔隙范围在100~250 μm之间的nano-HA材料对成骨更有利，是较为理想的支架材料。但是，Vaz等[19]认为500 μm微孔直径的nano-HA更合适骨细胞生长。

3.3 高分子聚合物

高分子聚合材料，包括多聚乳酸（PLA）、多聚羟基乙酸（PGA）、聚乳酸和聚羟基乙酸共聚物（PLGA）等，这类材料延展性好，可塑形，易降解，常用于关节软骨构建[20]。但聚合材料存在着细胞吸附力弱，材料降解时间不易控制等缺点。

3.4 复合材料

研究发现，如果将HA与高分子聚合物相融合所产生的复合物的力学性能将大为提升，克服了HA本身易碎的缺点，胶原-HA-PLGA、PEG、壳聚糖-HA、胶原-PLA-HA及PLC-HA等复合材料的实验研究均证实了这一点[21]。Hu等[22]认为，胶原/纳米羟基磷灰石（nano—HA/CO）具有良好的生物降解性，内部孔隙率达到84%，更接近于正常骨松质结构，利于成骨细胞的增殖分化以及新生血管的进入。而Teng等[23]研究发现，壳聚糖/n-HA复合物中两种物质具有良好的可混合性，当n-HA达到总量30%时，细胞碱性磷酸酶水平最高，但随着n-HA含量的增加，整个复合物的稳定性会有所下降。Isikli等[24]对壳聚糖-明胶/HA复合物进行抗压试验，得出弹性模数值和人的松质骨相近，细胞在该种材料上的黏附和增殖比在其他材料中要好。Xu等[25]把孔隙大小在300~500 μm的n-HA/PA66作为支架材料，认为更利于细胞的增殖和血管形成，尽管孔洞结构会造成复合材料的稳定性不够，但随着新生组织的爬行生长，会逐步改善材料的承重能力。

目前，对于复合材料的研究虽然取得了较大进展，但仍存在一定问题。各种材料在生物相容性、机械强度、降解速率、免疫原性等一系列指标上，能否达到理想水平，尚需要进一步的探索。

4 高压氧在BMSC联合支架材料修复骨缺损中的应用

研究表明，短期缺氧可促进成骨细胞的生长，但长期缺氧可抑制成骨细胞的生长、分化和骨形成能力。因此，随着缺氧时间的延长，成骨细胞的增殖能力开始下降[26]。高压氧用于延迟骨愈合、骨不连、放射性骨髓炎等疾病的治疗取得了显著的效果，是促进骨生长的重要因素。研究表明，高压氧（HBO）在治疗过程中，通过增加局部组织的氧分压，进而增加了胶原的合成和新生血管的形成，最终刺激新骨形成[27]。最新研究显示，高压氧处理有利于MSCs向成骨细胞分化，促进活体椎骨椎间骨融合[28]。 已经发现生理性或病理性的氧分压降低可引起骨量的丢失，但具体机制不明[29]。

如果先使BMSCs附着于载体，通过处理，细胞不但不会消失，而且可以形成新的骨组织，提高成骨能力。因此，选用适宜的细胞外基质作为载体，能够为细胞提供黏附及生长繁殖的空间，有利于组织再生。合适的载体系统是将MSCs运用到临床修复骨缺损的重要前提之一。研究结果表明，HBO并不干扰HA的骨再生作用，相反，HBO促进了新骨形成速度，提高了新骨的钙化程度[30]。另外，HBO能促进HA种植体在游离植骨上形成骨整合，有利于骨组织间的结合与骨的爬行替代[31]。

5 总结和展望

如果能够通过氧浓度因素实现干细胞分化、定向诱导的调控，可以避免化学因素对人体的危害，为干细胞分化、定向诱导开辟一条新途径，预防和治疗骨丢失，成为骨缺损修复的新方法。

BMSC构建组织工程化骨，用于骨缺损的修复，已在实验研究中取得了巨大的成就，也在临床应用研究中获得了一定的进展，但大规模的临床应用尚存在着诸多亟待解决的问题。随着组织工程学研究和相关学科的发展，骨组织工程技术修复骨缺损将成为全新的革命性的方法，并最终改变现有的治疗模式。

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BMSCs of Oxygen Preconditioning Combining Scaffold Materials in the Reconstruction of Bone Defects

LI Qingwei,ZHANG Cong,MENG Chunyang.Department of Orthopedics,Jining Medical College Affiliated Hospital,Shandong 272029,China.Corresponding author:MENG Chunyang(E-mail:plasurg0618@163.com).

Bone defect; Preconditioning; Hyperbaric oxygen; Scaffold materials

Q813.1+2

B

1673－0364（2013）01－0044－03

2012年10月28日；

2012年12月21日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.01.014

山东省自然科学基金（ZR2010HM090）；济宁医学院青年基金（2012056）。

272029 山东省济宁市 山东济宁医学院附属医院脊柱外科。

孟纯阳（E-mail：plasurg0618@163.com）。

【Summary】Bone mesenchymal stem cells (BMSC)are adult stem cells and can be differentiated into specific cell lines under certain conditions.BMSC as seed cells have showed good prospect in the reconstruction of bone defects.Oxygen Precondition with subsequent stress is carried out before planting scaffold materials to improve the cell survival and adaptation,so as to reduce or prevent the loss of seed cells.In this paper,the effects of BMSC after oxygen preconditioning combining scaffold materials in the reconstruction of bone defects were reviewed.