蜂胶及其活性成分抗心肌细胞氧化性损伤作用探析

■ 葛苗苗 孙丽萍 徐响 杜夏 王馨

（作者葛苗苗单位为中国农业科学院蜜蜂研究所，福建农林大学蜂学学院；孙丽萍、徐响单位为中国农业科学院蜜蜂研究所，农业部国家蜂产品加工专业分中心；杜夏、王馨单位为中国农业科学院蜜蜂研究所）

蜂胶是西方蜜蜂采集植物树脂后，混入蜂蜡和其它分泌物经加工咀嚼而成的一种粘稠物质。蜂胶作为一种天然活性物质，其成分极其复杂，具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性，是作为保健食品、药品制品的重要活性成分。

随着人们饮食结构的改变、空气质量不断下降以及我国老龄化现象的加剧，心血管疾病已逐渐成为威胁我国公民健康的重大疾病之一。心血管疾病的发病机制极其复杂，其中氧自由基引起的心肌细胞氧化性损伤是造成心血管系统结构与功能异常的重要原因之一。大量研究证实，许多心血管疾病的病理过程中都有过量的氧自由基产生，氧化应激状态下的活性氧自由基代谢紊乱是心肌细胞损伤甚至坏死的重要触发因素。因此，抗心肌细胞氧化性损伤是研究心血管疾病防治的重要切入点。本文对采用不同的氧化损伤模型研究蜂胶及其活性成分对心肌细胞氧化损伤的作用进行了总结。

抗氧化作用

蜂胶中含有多种活性成分，目前已鉴定出300多种物质，包括黄酮类、萜烯类、芳香酸及其衍生物、氨基酸、醛酮类物质，还有多种烃类物质、维生素、矿物质微量元素和酶等。蜂胶中的多酚物质极其丰富，并已鉴定出70多种黄酮类化合物，酚酸及其酯类近60种。研究表明，黄酮类物质、萜烯类物质和酚酸及其衍生物是蜂胶中的主要活性成分。因蜂胶黄酮结构中具有各种不同取代位置的酚羟基、不饱和键等，使其具有较高的抗氧化活性。

目前，国内外研究人员从蜂胶中分离、纯化出若干组分物质及化合物并采用体外氧化实验研究了其抗氧化作用。Katsuhiro H 等在分离蜂胶抗氧化成分时发现，蜂胶抗亚油酸氧化的能力较强，成分以artepillin C的含量最高。Nagai T等的研究表明，蜂胶的黄酮类化合物具有很强的供氢能力，它的抗氧化性优于茶多酚、丁基烃基甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)和丁基烃基茴香醚(BHA)，与维生素E相近。有实验进一步研究了蜂胶抗氧化能力与多酚含量的量效关系，并发现咖啡酸衍生物、槲皮苷、儿茶酚等物质对蜂胶抗氧化活性的关系密切。Rapta P等在证明了蜂胶醇提液中黄酮类和咖啡酸酯类具有较强的清除自由基和抗氧化能力的同时，采用测定氧化还原电势的方法分析出高良姜素、白杨素、咖啡酸苯乙脂（CAPE）和槲皮素等活性成分具有明显的抗氧化活性。

抗心肌细胞氧化性损伤的作用

现代临床表明，蜂胶除了具有抗菌消炎、治疗口腔疾病、抑制肿瘤和护肝作用外，还有使心脏肌肉抵抗阿霉素损伤、改善心血管系统的血液循环，预防和辅助治疗高血压、冠心病等作用。而氧自由基过量产生或机体内抗氧化防御机制减弱造成的自由基堆积可引起心肌细胞氧化性损伤，是多种心血管疾病发生与演变的重要细胞学基础。因此，利用蜂胶的抗氧化性预防心血管疾病的发生及发展是许多相关领域研究的重点。目前，研究过程中广泛使用的氧化损伤模型有药物损伤、H2O2损伤、化学损伤以及电辐射等。

对药物诱导的心肌细胞氧化性损伤作用

抗生素是微生物或高等动植物在生命活动中产生的一类次级代谢产物，广泛应用于各种恶性肿瘤治疗。但长期服用会产生剂量依赖性心脏中毒，诱发严重心脏毒性，甚至导致心力衰竭或心脏停搏。关于抗生素引起的心脏中毒分子机制还未涉及，但其诱导的氧化应激反应机制已被多位学者证实。医学临床应用较广泛的抗肿瘤抗生素有阿霉素、柔红霉素和链唑霉素等。在建立药物损伤模型时，一方面可以利用实验动物建立体内氧化损伤模型，另一方面可通过原代细胞培养和H9C2细胞株的传代培养建立体外氧化损伤模型。

体内氧化损伤模型的建立主要采用静脉、腹腔注射和口服的方式给药，并根据实验目的选用药物预处理或者后处理方式。Chopra S等采用阿霉素Wiser成年大鼠损伤模型研究蜂胶醇提物对心肌氧化性损伤的作用。实验中连续5d以50、100 mg/kg的剂量向大鼠体内静脉注射蜂胶醇提物，并于第5d注射10 mg/kg的阿霉素致损，30 mg/Kg的芦丁为阳性对照。24h后收集血液和心脏组织进行生化指标检测和生理病理的研究。结果经蜂胶醇提物预处理后，受损鼠血清中的肌酸激酶（CK）、血液和组织中的谷胱甘肽（GSH）以及心脏中硫代巴比妥酸还原产物（TBARS）的水平明显降低。Okutan H等以35 mg/kg的浓度向鼠体内连续3d静脉注射链唑霉素（STZ），之后连续8周每天以10 μmol/L的剂量静脉注射CAPE，通过检测心肌组织中MDA、SOD、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）研究CAPE抗心肌氧化损伤的作用。与空白组相比，CAPE处理组鼠的心脏组织中MDA含量显著降低；与未经CAPE后处理的损伤鼠相比，CAPE处理组鼠的心脏组织中SOD和CAT活性降低但GSH-Px活性显著提高。从而得出CAPE通过其抗氧化活性可明显改善心肌细胞的氧化应激损伤。

在体外氧化损伤模型建立方面，需要有目的性地选择原代培养心肌细胞或者采用细胞株进行实验。相关实验结果表明，在蜂胶活性的验证方面，两种细胞的实验结果是一致的。Mojzisová G 等通过体外培养成年鼠的心肌细胞，测定LDH漏出率和采用MTT法检测细胞存活率比较槲皮素、松树皮萃取物和4,5,7-三氢黄烷酮抗柔红霉素诱导的心肌中毒作用，生育酚为阳性对照。各黄酮类物质与柔红霉素共同孵育24h后，10-4～10-6mol/L浓度范围内的槲皮素和4,5,7-三氢黄烷酮都可显著提高心肌细胞的存活率，松树皮萃取物的活性稍差。另一方面，所检测黄酮类物质都可抑制柔红霉素诱导的LDH漏出率，且活性明显高于生育酚。Zisová G采用H9C2细胞株比较以上几种黄酮类物质抗心肌细胞毒性的作用。结果与柔红霉素共同孵育24h后，槲皮素在10-4～10-5mol/L的浓度范围内可明显提高心肌细胞的存活率。而其他化合物只是在最高浓度下有保护作用；共同孵育48h后，槲皮素和4,5,7-三氢黄烷酮可在10-4～10-5mol/L明显降低细胞的死亡率，而松树皮萃取物和生育酚在此浓度范围内的心肌细胞保护作用较弱。实验结果还表明，槲皮素和4,5,7-三氢黄烷酮可抑制心肌细胞凋亡。此实验同样证明了槲皮素是一种有效的抗心肌细胞氧化损伤的化合物，与原代心肌细胞的实验结果具有可比性。因此，H9C2细胞株可作为一种有效的心肌细胞外损伤模型。

国内学者多采用体外氧化损伤模型用于蜂胶活性的验证，并取得一致性的结果。原代培养的大鼠乳鼠心肌细胞作为实验材料，柔红霉素和不同浓度（25、50、100 μmol/L）的槲皮素共同孵育24h后，吉姆萨染色后显微镜下观察细胞形态变化，流式细胞仪下检测细胞凋亡率，并采用相应的试剂盒检测LDH、SOD和MDA等与氧化相关的指标。结果与柔红霉素损伤组相比，经槲皮素处理的心肌细胞碎片减少，细胞凋亡率、LDH和MDA的含量降低，SOD活性和线粒体脱氢酶活性增高，且存在剂量效应关系。

对H2O2诱导的心肌氧化损伤的作用

H2O2是超氧阴离子自由基歧化生成的一种氧化能力很强的活性氧，它与细胞内铁离子通过Fenton反应生成高活性的羟自由基且通过级联反应生成更多自由基。外源性H2O2易于获得、性质相对稳定，且极易透过细胞膜，其作用于心肌细胞后破坏心肌细胞膜、影响线粒体功能、造成细胞供能障碍，是研究蜂胶抗氧化作用的重要工具。

H2O2处理多为体外氧化损伤，可更有效地研究蜂胶抗心肌氧化损伤的作用。Sun X等用不同浓度的木犀草苷预处理H9C2细胞4h，150 μmol/L H2O2孵育6h后进行形态学研究和生化指标的测定，用于研究木犀草苷对H2O2诱导的心肌细胞凋亡的作用并从细胞学、形态学和分子水平上研究其抑制细胞凋亡的作用机制。结果木犀草苷可通过增强SOD、GSH-Px以及CAT的活性，明显减少细胞凋亡率，提高抗凋亡蛋白Bcl-2、降低凋亡蛋白Bax的表达量，抑制凋亡因子的释放量，调节H2O2诱导的线粒体功能紊乱。数据还表明木犀草苷可通过显著抑制JNK和P53蛋白的表达量来抑制细胞凋亡。采用相同的H2O2损伤条件，研究异鼠李素对H9C2细胞的作用结果显示，0～25 μmol/L的异鼠李素对心肌细胞的保护作用呈剂量依赖性，并将25 μmol/L筛选为后续细胞凋亡率以及与凋亡机制相关指标测定时的预处理浓度。最终结果表明，异鼠李素抑制细胞凋亡的机制可能与激活Caspase-3、9，维持线粒体膜电势，调节Bcl-2家族基因表达以及可使与细胞凋亡通路相关的ERK和P53失活有关。

Akhlaghi M等采用H9C2心肌细胞模拟心肌缺血-再灌注损伤和叔丁基H2O2损伤，比较5种黄酮类物质对受损心肌细胞的保护作用。采用显微观察和观察甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的活性直接和间接地测定细胞存活率。在缺血-再灌注损伤之前，用不同剂量的黄酮类物质对心肌细胞预处理2-3d。结果儿茶酚具有明显的保护作用，槲皮素在5 μmol/L下有保护作用，但浓度增加会对细胞产生毒性。在氧化损伤模型中，用400 μmol/L浓度的H2O2氧化损伤24h前，在25 μmol/L黄酮类物质的长时预处理（3d）中，只有槲皮素具有显著的保护作用，而其他物质则表现出较明显的细胞毒性；在50 μmol/L浓度下的短时预处理（1h）中，黄酮类物质没有表现出明显的细胞毒性，且除槲皮素外，儿茶素也表现出明显的保护作用。结果表明，儿茶素可有效预防缺血-再灌注损伤，槲皮素则对预防心肌心肌的氧化应激损伤效果明显。

选用原代培养的乳鼠心肌细胞作为实验材料的实验结果同样证明了，槲皮素可减少H2O2导致的心肌细胞形态学变化，降低LDH漏出率和MDA产生量，保护SOD活性，具有抵抗细胞氧化损伤的作用。

对化学损伤诱导的心肌细胞氧化损伤的作用

Nabavi SF向鼠体内连续7d静脉注射10 和 20 mg/kg的槲皮素，之后以600ppm的剂量连续7d静脉注射氟化钠，测定心脏组织上清液中的SOD、CAT和还原性GSH活性等指标，研究槲皮素对氟化钠诱导的心脏氧化损伤的保护作用。结果，心脏经槲皮素预处理后其与氧化有关的指标明显改善。

金毅等采用聚酰胺柱层析分离得黄酮含量为22.5%蜂胶黄酮类提取物，Fe2+/半胱氨酸损伤原代培养的SD大鼠心肌细胞，研究蜂胶对氧化损伤心肌细胞的保护作用，并以槲皮素为阳性对照。细胞经25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL的蜂胶黄酮提取物和25 μg/mL的槲皮素预处理1h，加入Fe2+/半胱氨酸损伤24h后，测定细胞中MDA含量、SOD活性和LDH漏出率。2008年，隋玲娟用改良的聚酰胺柱层析方法和同样的氧化损伤模型比较了蜂胶醇提物和槲皮素对氧化损伤性心肌细胞的保护作用。结果，蜂胶醇提物的过氧化损伤和保护SOD活力的作用强于槲皮素，但对心肌细胞的脂质过氧化反应的抑制作用则弱于槲皮素。

对其他因素诱导的心肌细胞氧化损伤的作用

电磁辐射通过提高自由基影响生物系统，增强脂质过氧化反应，改变人体组织抗氧化防御系统，从而导致氧化应激反应。因此有学者用动物模型研究CAPE对900MHZ电磁辐射诱导的心肌细胞氧化损伤的作用，CAPE处理组在接受辐照之前每天注射CAPE，剂量为10 μmol/mL，每天900MHZ电磁下辐照30min，连续辐照10天，电磁辐射组中，MDA和NO水平提高，SOD、CAT以及GSH-Px活力降低。CAPE处理组可明显将结果转变。

另有学者选用连续超负荷训练4周的小鼠为实验材料，研究蜂胶黄酮对疲劳诱导的心肌自由基代谢和ATP酶的影响。从处死小鼠提内取出心脏，匀浆化，离心去上清液，测定MDA、SOD、GSH-Px、CAT以及ATP酶的活性。结果蜂胶黄酮处理组小鼠SOD、GSH-Px、CAT的活性均明显高于对照组，而MDA含量则低于对照组，并明显抑制了由疲劳导致的ATP酶活性的降低。从而得出蜂胶黄酮可提高机体抗氧化能力，减少自由基对细胞的氧化性损伤。

目前，蜂胶抗心肌细胞氧化作用的研究还处于初级阶段。所用的氧化损伤模型多数采为H2O2损伤和阿霉素、柔红霉素等抗生素氧化损伤。对化合物的活性研究方面，也仅涉及了蜂胶中含量较高或者活性较明显的化合物。而诱导心肌细胞氧化应激反应的因素是多方面的，且各因素的主要氧化机制也不尽相同。蜂胶作为一种天然活性物质，其成分极为复杂，且不同的产地、不同的胶源物质以及不同的采集季节，蜂胶的化学成分存在差异，蜂胶的抗氧化作用也存在差异。因此，蜂胶的活性验证及抗心肌细胞氧化损伤的机制研究还需要更全面、深入、系统化。