聚焦蜂王浆主蛋白功能研究

■ 苏松坤 陶挺 缪晓青

（作者苏松坤单位为福建农林大学蜂学学院、浙江大学动物科学学院；陶挺单位为浙江大学动物科学学院；缪晓青单位为福建农林大学蜂学学院）

由同一只蜂王产下的受精卵发育成的幼虫若在整个幼虫期都喂蜂王浆，幼虫只需13天就发育成性器官完全的蜂王；若在前三天喂蜂王浆，之后喂蜂粮(蜂蜜和花粉的混合物)，幼虫18天后才发育成性器官不完全的工蜂。蜂王在繁殖高峰期，每天的产卵数达到2000粒，超过自身的体重。蜂王浆的寿命一般是2~3年，而工蜂寿命只有30~40天。蜂王浆神奇的功效引起了许多科学家极大的兴趣。

蜂王浆(Royal Jelly, RJ)是哺育蜂咽下腺与上颚腺分泌的供3日龄以内蜜蜂幼虫和蜂王食用的浆状物质。蜂王浆中一般含水量为64.5～68.5%，蛋白质12～14%，碳水化合物8.5～16%，脂类6%，灰分0.4～2%，其它物质2.84～3%。其中王浆蛋白由水溶性蛋白和非水溶性蛋白组成，水溶性蛋白占总蛋白含量的46～89%，为王浆蛋白的主要部分，称为王浆主蛋白 (MRJPs, Major Royal Jelly Proteins)。

人类对蜂王浆的认识有200多年的历史。葛凤晨研究员等考证了17世纪中国人采集利用东方蜜蜂王浆的历史，并在文中指出了下列事实：1792年弗郎克斯·哈伯(Francois Huber)首次提出王浆一词；1852年美国朗斯特罗什先生收集了足够数量的蜂王浆请化学家对蜂王浆的成分进行分析研究；1888年德国化学家A. Von. Pianta对蜂王浆的组分进行一般性的研究；20世纪20年代，加拿大一养蜂者随意将蜂群中多余王台削下来被母鸡吃掉，第二天母鸡产下一个较大的鸡蛋，这一发现引起科学家的注意。从此，蜂王浆的研究和利用历史事例越来越多，但对蜂王浆进行包括生物学、化学、药理和临床实验的全面研究，还是最近几十年才开始的，至今人们对蜂王浆中的一些微量生物活性物质还未完全研究清楚。

蜂王浆的许多功能与其所含的蛋白组分有关，但由于其组成复杂，且有些成分在分离过程中易失活，因此很多研究都集中在王浆整体水平上，而未阐明王浆为什么会有这些功能，怎样产生这些功能，是哪种组分产生了这些功能；受试对象也主要集中在动物个体水平，而鲜有达到细胞分子水平。

对王浆蛋白单一组分研究的缺乏限制了其应用范围，近年来，随着基因工程、分子生物学、蛋白质组学及现代分析、分离技术的发展，一些蛋白组分已经得到分离或在大肠杆菌中得到表达并进行了功能实验，这对进一步阐明王浆蛋白组分的生理生物活性，扩大其应用范围，无疑具有重要意义的。

王浆蛋白功能呈多样化

蜂王浆整体水平功能研究的全面铺开已有几十年的历史，主要表现为免疫调节、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、促细胞生长、促繁殖、抗疲劳、降血压、预防骨质疏松、预防甲状腺素诱导的肝损害、营养神经等功能；近几年来，王浆中的某些单一蛋白组分，如MRJP3、Jelleine-I-IV、Royalisin、MRJP1、57-kDa蛋白、Apisimin等也己得到分离或表达，并进行了功能实验。

免疫调节功能

早在1996年，Lidija sver等就发现王浆通过刺激抗体产生和免疫活性细胞增殖而起到免疫调节的作用，但人们还不知道到底是何种组分发挥了作用。在随后的研究中，人们还发现王浆能抑制DNP-KLH小鼠的过敏反应和NC/Nga小鼠特应性皮炎样病变。但是只有Iwao Okamoto等的研究揭示了MRJP3的抗过敏作用。他们通过OVA/alum免疫小鼠经anti-CD3刺激衍生的脾细胞抑制IL-4的产生从王浆中筛选抗过敏因子，采用一系列柱色谱分析，分离纯化了一个70 kDa的糖蛋白，即MRJP3。

体外试验表明，MRJP3不仅能抑制IL-4的产生，还能通过抑制T细胞增殖而抑制IL-2和IFN-γ的产生。更有意思的是，MRJP3作为外源蛋白本身具有抗原性，经腹膜注射能抑制免疫小鼠血清anti-OVA IgE和IgG1的水平，而热处理能降低其抗原性。这些结果表明MRJP3在体内外均有免疫调节的作用并可能会被应用于临床治疗。

抗菌功能

Renato Fontana等从蜂王浆中分离了四种抗菌肽，这些抗菌肽属于同一个蛋白质家族Jelleines，并分别命名为Jelleine-I、Jelleine-II、Jelleine-III、Jelleine-IV。研究人员通过氨基酸测序，体外合成、纯化，进行了一系列的生物学实验。他们通过测定抗菌肽的抗菌活性、肥大细胞脱颗粒活性和溶血试验，发现Jelleine-I-III对酵母、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌有特异性抗菌作用，而Jelleine-IV在所有的试验中均表现抗菌性。这些抗菌肽与蜜蜂体内的其它抗菌肽没有任何相似之处，它们由工蜂产生并分泌到王浆中。研究人员通过数据库检索比对，还发现Jelleine-II C-末端 9个氨基酸序列与王浆中MRJP1 C-末端 9个氨基酸序列完全一致，提示Jelleine-II可能是MRJP1经胰蛋白酶作用后的产物。通过胰蛋白酶部分具蛋白质外切酶活性片断的作用，MRJP1还能形成Jelleine-I和Jelleine-IV，提示MRJP1可能是Jelleine的前体物质。

Katarina Bachanova等报道了王浆中一种新的抗菌多肽Royalisin，并发现Royalisin对蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原(Paenibacillus larvae)及其他受试革兰氏阳性菌有杀灭作用。

抗肿瘤功能

Claudia Bincoletto等在2005年发现王浆能阻碍因肿瘤细胞生长而导致的骨髓抑制，但成分未知。斯洛伐克学者Juraj Majtan等运用基因工程的方法，在体外表达了重组的Apa1并进行了功能实验，发现其能刺激巨噬细胞释放肿瘤细胞坏死因子(TNFα)。令人感兴趣的是，重组Apa1经胰蛋白酶部分消化后，其免疫刺激功能显著增强。相关实验表明，Apa1的N-端重组片断较其它三个蛋白片断活性最强。

促细胞生长功能

日本科学家Masaki Kamakura等研究了王浆57-kDa蛋白的生理学作用，他们通过对大鼠原代肝实质细胞的培养，发现57-kDa蛋白能显著地促进肝细胞的DNA合成，而常用的牛血清却无此作用。此外，57-kDa蛋白还能增加清蛋白（亦叫白蛋白）的合成，促进细胞增殖，提示57-kDa蛋白可能起到细胞分裂素的作用。随后，57-kDa蛋白的作用机理也被阐明。2002年被K.Bilikova,J.Hanws等人发现的小肽Apisimin在随后的实验中也被证明有刺激人单核细胞增殖的作用。

L.A.Salazar-Olivo等从王浆中提取粗蛋白(RJCP)并发现其能刺激昆虫Tn-5B1-4细胞生长，每毫克蛋白添加剂能使细胞数量比对照组多6.5倍，而通常用的胎牛血清却只有2.55倍，这些粗蛋白与用硫化胺从王浆中沉淀的RJP30和RJP60效果一样，都能影响细胞的形状，刺激细胞的粘附。

RJP30能够刺激鼠科动物的3T3-F442A前脂肪细胞转化为成熟脂肪细胞，其效果比胰岛素好2倍，粗蛋白和RJP60也有类似效果。RJP30还能对海拉人类子宫癌细胞产生生长抑制作用，用RJP30处理七天后，细胞数目减少2.5倍。以上结果表明了王浆蛋白对于细胞生长作用的多样性，它对昆虫、鼠科动物和人类癌细胞分别有促生长、促分化和抑制生存的作用。

抗高血压功能

ToshiroMatsui等报道完全蜂王浆和它的分离蛋白根本不会阻碍血管紧缩素I－转化酶(ACE)的活性，然而，蜂王浆经胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解后，其产物具有抑制血管紧缩素的作用，从而起到降血压的作用。采用液相色谱法对王浆水解产物进行分离，获得二肽、三肽片断，并发现了11个ACE的抑制肽，其中有8个肽是首次从自然资源中鉴定出来的。因此，王浆蛋白被认为是一种可通过胃肠酶水解获取ACE抑制肽的好资源。陶挺等（2008）报道在家蚕细胞和幼虫体内成功表达中华蜜蜂MRJP1蛋白，经Western检测证实，纯化获得中华蜜蜂MRJP1蛋白表达产物，对中华蜜蜂MRJP1蛋白表达产物经蛋白酶解，质谱鉴定在中华蜜蜂MRJP1蛋白表达产物酶解产物中发现抗高血压二肽（Ile-Phe）。

其它功能

鉴于王浆蛋白组分的复杂性，其功能也呈现多样化，Stefan Albert等曾指出MRJPs是在进化过程中产生功能分歧的。除了以上几种主要功能外，以下功能也已经见诸报道。

Kamakura M等报道王浆有抗疲劳作用，这可能与王浆中57-kDa蛋白有关，且与其含量高低呈剂量效应。

2011年4月24日，《Nature》报道了日本富山县立大学镰仓昌树博士发现蜂王浆中的一种57-kDa蛋白（也称Royalactin）使蜜蜂幼虫变成蜂王。这种蛋白质在果蝇上有类似的效果。研究发现，royalactin能激活一种叫做p70 S6激酶，这个激酶对幼虫体型的变大有重要的作用，它能够增加细胞分裂素活化蛋白激酶的活性（该酶在缩短虫体发育时间中起重要作用），提高卵巢管发育必需的保幼激素水平。镰仓昌树研究发现，敲除蜜蜂和果蝇脂肪体中的表皮生长因子受体（Egfr），能阻碍royalactin诱导的所有形态变化。这些研究表明，royalactin是蜂王浆中的一个通过Egfr-调节信号通道来诱导幼虫发育成为蜂王的特殊因子。经蛋白氨基酸分析比对发现，Royalactin的一级结构与MRJP1的结构相同。

王浆蛋白的分子生物学研究现状

上个世纪，由于科学发展水平的限制，人们主要采用化学分析的方法对王浆组分进行粗略的分析及王浆整体水平上的功能实验；然而，这些方法已经无法满足功能如此纷繁复杂的王浆蛋白分析的需要。目前，人们迫切需要知道的是在这些复杂的功能背后，到底是何种组分发挥了作用，到底存在怎样的作用机制。

本世纪，王浆蛋白分子水平的研究悄然展开，这得益于现代科学技术的发展。2006年10月26日，《Nature》杂志发表了蜜蜂基因组的全序列；随后，《Science》杂志也在当年10月27日和12月15日相继发表了三篇评论，指出了蜜蜂基因组序列对于研究昆虫的进化和社会性行为的重要意义。这一历史性的成果标志着蜜蜂基因组研究工作的大跨越，必将对以后蜜蜂基因功能和王浆蛋白功能的研究产生重大影响。

目前，王浆蛋白的分子水平方面的研究主要集中在MRJPs家族，目前已知的成员有MRJP1、MRJP2-4、MRJP5、MRJP6-8。Drapeau MD等报道了MRJP9，还指出了MRJPs基因家族中一个新的假基因编码一个不完整的多肽，这个多肽可能成为MRJPs家族的第十个成员，研究人员还将这个基因命名为MRJP-ψ。其中MRJP2、MRJP3、MRJP5基因均存在重复序列多态性；而MRJP3-5、MRJP7基因则均存在单核苷酸多态性(SNPs)。

MRJPs包含大量的必须氨基酸，在蜜蜂的营养中起着重要作用。另外，多态重复区域在MRJPs基因家族进化中出现得很早，这也可能与蜜蜂增加自身氮储藏量，保证自身营养有关。在近来的研究中，有关MRJP1的报道频频出现。MRJP1是一个分子量约为56-57kDa的糖蛋白。它具有高度的保守性，且在王浆中含量最丰富。不同于其它家族成员的是，Kucharski, R等报道MRJP1在蜜蜂大脑的蘑菇体表达，提示MRJP1可能在蜜蜂的行为中起作用。

蛋白质组学技术也被应用到王浆蛋白研究中，Scarselli R等用蛋白质双向电泳、质谱、de novo测序技术研究了王浆的蛋白质组，发现了MRJP1-3的前体及几个MRJP1和MRJP3的片断，这可能是由于王浆中存在蛋白酶的原因。Keity Souza Santos等同样用蛋白质双向电泳技术，从王浆中分离了61个多肽点，其中34个已经确定，有27个蛋白质是MRJPs成员。利用蛋白质组学技术平台，中国科学家建立了MRJP5作为蜂王浆新鲜度指标的免疫检测方法。

本实验室在这方面进行了积极的探索，构建了中华蜜蜂（Apis cerana cerana）8日龄的工蜂头部cDNA，成功克隆了编码中华蜜蜂王浆主蛋白基因MRJP1、MRJP2、MRJP3、MRJP5、Apisimin的全长cDNA序列，并对它们的全序列进行了测定与分析。此外，还发现了中蜂MRJP2基因一个新的多态重复区域。并在原核表达（大肠杆菌等）系统和真核表达（家蚕等）系统进行表达和产物功能研究，取得可喜进展。

历史契机成有力研究工具

在各国科学家的不断努力和探索下，王浆蛋白的功能研究已经取得了不少进展，且已成为当前蜂王浆研究的热点。人类的实践也已证明王浆蛋白的诸多优良生物活性，但鉴于其成分的复杂性和功能的多样化，仍有许多问题亟待解决。分离纯化王浆中的功能蛋白或将王浆主蛋白基因克隆表达并阐明其作用机理，已成为当务之急。现代分析分离技术及基因工程、分子生物学、蛋白质组学的发展和蜜蜂基因组测序的完成，又给这一研究带来了历史性的契机，成为这一研究强有力的工具。

而王浆也不仅仅只用于人类保健品和相关药品的生产，更会应用到诸如细胞培养、组织工程等领域，促进科学技术和人类社会的发展。我们有理由相信，在全球科学家的共同努力下，阐明王浆蛋白复杂的组分及其功能不再是一个神话。