蜂毒肽抗肿瘤研究新进展

■ 杨小浪 董江涛 陈文彬 缪晓青

(作者杨小浪、董江涛、陈文彬、缪晓青单位为福建农林大学蜂学学院、蜂疗研究所)

蜂毒是蜜蜂工蜂毒腺分泌出来的一种具有芳香气味成分复杂的混合物，主要含有蜂毒肽、蜂毒明肽、肥大细胞脱粒肽等多肽类；另外还有透明质酸酶、磷脂酶A2等50多种活性酶类，以及组织胺、多巴胺等生物活性物质。蜂毒中研究较多的是蜂毒肽，它是一种水溶性阳离子两亲性细胞毒肽。蜂毒肽占蜂毒比重的45～50%，是蜂毒中的主要功能物质。蜂毒肽呈碱性和正电性，易溶于水，相对分子质量为2800左右，具有消炎、降压、镇痛、抑制血小板凝集、抗辐射、抗菌、抗病毒(如抗HSV—l病毒、抗HIV)、抗风湿性关节炎及抗肿瘤等多种药理活性[1-2]。近年来研究较多的抗肿瘤、抗艾滋病毒的作用，引起了人们的极大关注。

近几年关于蜂毒肽抗肿瘤作用及其相关机理的研究很多。已有研究表明，可以有效地抑制骨肉瘤细胞、胃癌细胞SGC一7901、肺癌细胞NCI—H1299、肝癌细胞SMMC一7721，并诱导肿瘤细胞凋亡；促进IL-2生成、NK细胞增殖，诱导T细胞增殖分化，增强细胞免疫功能。因此，蜂毒肽是一个非常具有应用前景的抗肿瘤天然药物。

但是，其临床应用却有很多局限，具有溶血活性，致敏反应，非特异性，非靶向毒性等可能引起的毒副作用，以及血液中的血清肽酶的裂解，降低其有效的药理作用等。另外蜂毒肽的获得还有一定局限性，现有的技术还难以将蜂毒中有致敏反应且与蜂毒肽分子量接近的磷脂酶A2完全去除。基因工程的出现不失为一条有效途径。通过基因工程获得蜂毒肽的方法已经取得一定进展，但仍有许多不足之处，距离大规模生产还有很长的一段路。

多靶点、多种机制协同作用的蜂毒肽

人类社会利用蜂毒的历史悠久，同时人们对蜂毒和蜂毒肽的研究也在不断深入。自从1952年Netumar等人用电泳法分离获得蜂毒肽以来，关于蜂毒肽的研究拉开了帷幕，很多研究发现蜂毒肽对体内外多种肿瘤细胞都有杀伤作用。1972年，Habermant报道1μmol/L的蜂毒肽就能阻止肿瘤细胞增殖但却不抑制正常细胞的生长与克隆率。1996年，Arora通过对正常大鼠肝细胞与大鼠肝癌细胞抗缺氧损伤能力的实验对比，证实蜂毒肽激活磷脂酶A2(PLA2)能够解除肝癌细胞对缺氧的抵抗。DUnn等将来自于鼠抗人骨髓瘤细胞和淋巴瘤细胞表面特异蛋白的抗体SCFV基因同蜂毒肽基因相融合，构建了能杀肿瘤细胞的抗毒素基因，大肠杆菌中融合基因并表达，精制的抗毒素显示了体外杀死肿瘤细胞的效能。国内外关于蜂毒肽抗肿瘤作用研究比较多，认为其抗肿瘤作用是一个多靶点、多种机制协同作用的结果，诱导细胞凋亡、直接杀伤肿瘤细胞、抑制细胞周期、抑制血管生成、调节免疫力等相关机制各类文献均有报道。

在细胞外就可破坏肿瘤细胞的毒性

蜂毒肽是阳离子两亲性多肽，而两亲性是膜结合肽和膜蛋白跨膜螺旋的基础，所以具有膜活性，能直接对细胞的磷脂膜起溶解作用，破坏细胞膜而导致细胞死亡，因此它不用进入细胞，在细胞外即可显示出其破坏肿瘤细胞的毒性。蜂毒肽与膜作用时，随着时间的变化、四聚体衰变为稳定的三聚体和单体。这个持续的构型变化将伴随着含水孔的横向扩张，主要由α一螺旋之间的静电排斥造成孔增加，因此细胞裂解。

1999年，Kubo等用5种细胞毒的测定方法对蜂毒肽与嗜酸性粒细胞的主要碱性蛋白进行比较，结果证实蜂毒肽能插入K562细胞的胞膜中进而形成孔道，引起Ca2+内流使胞内Ca2+浓度升高，细胞裂解，最后导致在lh内蜂毒肽对实验的白血病细胞均具杀伤效果。2008年，Van den Bogaart G等关于蜂毒肽对细胞膜的钻孔机理的研究，提出了蜂毒肽对两亲性磷脂体组成的细胞膜同时存在着两种作用模式：键合和钻孔，而且这两种模式互相竞争。这个与Kourie JI和Trinh LB提出的毯式和穿孔模型相吻合，蜂毒肽能直接作用于细胞磷脂膜使之裂解，从而抑制细胞生长发育。键合模式中蜂毒肽分子与细胞膜表面平行，钻孔模式中蜂毒肽分子则垂直插入到细胞膜表面内。并提出了一种蜂毒肽分子对细胞膜钻孔的两步模型：低浓度时平行键合，高浓度时转向垂直朝向(A、B中的2)，引起钻孔。但从乎行状态转向垂直状态很难被理解，因为+5价中性pH值蜂毒肽分子和磷脂体首基团有强烈的相互作用，转变的能量很高。

另外，研究发现蜂毒肽会以同样的方式作用于细胞内细胞器的膜，如蜂毒肽渗透线粒体膜，并使其肿胀，进一步释放细胞色素C和诱导细胞凋亡。另有研究发现蜂毒素使细胞线粒体膜溶解，使细胞的正常呼吸受到抑制，因而肿瘤组织氧化磷酸化的过程受到抑制，氧化功能被破坏，导致肿瘤组织生长抑制。

肿瘤的发生与细胞凋亡受阻有关

细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death，PCD)，是细胞的一种不同于坏死的死亡方式，是细胞由基因控制的一种生理性死亡，同细胞的增殖、分化一样，是由基因控制的主动的细胞生物学过程。而肿瘤的发生、发展不仅是细胞增殖和分化异常的结果，也与细胞凋亡受阻有关。

近几年来，有关蜂毒及蜂毒肽抗肿瘤的机制研究取得新的进展，众多研究发现蜂毒及蜂毒肽的抗肿瘤生物活性是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的，而诱导凋亡又是通过诱导相关凋亡基因和蛋白的表达实现，如通过Caspases途径诱导细胞凋亡、Bcl-2和BaX的蛋白表达。2001年，黄雪强等通过人白血病细胞观察蜂毒肽促凋亡的作用，结果发现对白血病细胞5 mg／mL蜂毒肽作用4 h与4μg／mL蜂毒肽作用24h都可见典型凋亡特征，进一步实验发现其诱导细胞凋亡同bcl-2基因表达显著下降相关。2004年，Ahn等报道，蜂毒素诱导肺癌细胞凋亡与增加Bax蛋白表达、激活半胱氨酸蛋白酶有关。2007年，张晨等研究显示蜂毒素可诱导肝癌细胞BEL-7402线粒体膜蛋白7A6的表达和凋亡相关基因产物Fas及其配体FasL信号传导途径，进而促进细胞凋亡。2012年王怡苹等认为蜂毒素诱导胃癌细胞系SGC-790l细胞凋亡的机制与调节p53、BaX和Bcl-2等相关基因的表达有关。可以看出蜂毒肽诱导肿瘤细胞凋亡与其调节相关基因及蛋白的表达有关。

另外有研究显示通过影响细胞内转导介质、影响细胞转导信号以及影响细胞周期从而促进细胞凋亡。影响细胞内转导介质方面，如对凋亡诱导剂Ca2+的影响和诱导神经酰胺合成(神经酰胺是一种新的细胞内第二信使，具有激活蛋白激酶、调节蛋白的磷酸化和影响磷脂酶A2(PLA2)活性等多种生物学功能，而且神经酰胺被认为是引起细胞生长、分化和凋亡的有效诱导剂)。影响细胞转导信号方面，Hao等在试验中发现MAPK通路中的FRK、P38、JNK的表达受到蜂毒肽的影响。Wang等报道蜂毒肽能够通过活化CaMKII-TAK1-JNK／p38途径，同时抑制IKKNF-KB途径诱导HCC细胞凋亡，并且能够通过此方式增强HCC细胞对凋亡诱导剂TRAIL的敏感性。蜂毒肽作用于细胞膜后触发了PI3K—Akt和MARK—ERK等信号转导通路，进而引起Caspase家族和bcl-2家族的变化，诱导细胞凋亡。影响细胞周期促进细胞凋亡方面，张晨等通过实验证明蜂毒素通过减少PCNA阳性细胞的表达、影响细胞周期的比率来抑制肝癌细胞SMMC7721的生长、增殖。李玉梅等亦证明蜂毒素可减少骨肉瘤U20S细胞的PCNA阳性细胞的表达，干扰肿瘤细胞的细胞周期、阻止S期细胞进入G2／M期，造成S期细胞的聚集，进一步促进细胞凋亡。

直接作用于机体免疫抑制肿瘤血管生成

国内外有研究报道，蜂毒肽可能通过参与免疫调节和抗血管生成途径达到抗肿瘤效应。王秋波等的研究表明，蜂疗后机体血浆及诱导巨噬细胞产生的IL-2含量明显增高，而IL-4含量无明显变化，同时血浆中的IgG、IgA、IgM，C3的量在蜂疗前后无明显变化，证实了蜂毒肽对机体免疫系统有直接作用，蜂毒肽通过增强THl细胞功能，对机体细胞免疫功能起正向调节作用。宋长城等认为下调VEGF和bFGF的表达，进而抑制肝癌血管生成可能是其抗肿瘤作用的重要机理之一。高启龙等在蜂毒素对骨肉瘤UMR-106细胞裸鼠移植瘤血管生成影响的试验中证明，蜂毒素治疗组VEGF、HIF-1α蛋白阳性表达率均有所降低，同时检测到CDl05阳性率明显降低，表明新生血管数目明显减少。亦有实验证明，蜂毒素可显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成，并且呈现浓度依赖关系。

减毒增效研究

由于蜂毒肽具有破坏细胞膜、溶血活性、致敏反应的毒副作用，以及存在易被血液中的血清肽酶的裂解而降低其药效的问题，限制了蜂毒或蜂毒肽的临床应用。另外其为水溶性多肽，通过口服给药会破坏其活性。为了解决这一系列问题，国内外学者进行了相关的减毒增效研究。

化学或基因重组的蜂毒肽优化

针对蜂毒肽较差的药代动力学和非靶向毒性，一些科学家通过化学或基因重组方法改变蜂毒肽的结构对其进行优化。1993年，Baker等通过化学方法改性阳离子两亲性多肽-Melittin，以改善其在体内的药代动力学性质和降低毒性。Melittin由于自身存在的L-amino acids，易于被肽酶水解，这限制了蜂毒肽在血液中的半衰期，并减少了它们的口服生物利用度。因此用D-amino acids或含有不同侧链的非天然氨基酸部分或全部取代L-amino acids，但不影响其抗肿瘤效应。另外，通过与靶向肽共轭链接，达到靶向组织或靶向细胞，以改变其较差的药代动力学和非靶向毒性，如蛋白质转导结构域，整合素受体配体和5个氨基酸的线性长肽CREKA均能选择性地识别肿瘤血管和基质中的凝结血浆蛋白类。

通过载体介导重组基因编码蛋白，导入肿瘤细胞，可以避免其较差的药代动力学和非靶向毒性。1996年，Dunn领导的研究小组对蜂毒肽抗癌作用进行了研究，通过融合基因编码并在大肠杆菌中进行表达，得到由一个肽链接器将蜂毒肽与scFV抗体片段结合的具有靶向肿瘤细胞的蜂毒肽(scFv-mel)，其解决了蜂毒肽的非特异性毒性，同时增加了其靶向性和抗肿瘤活性。在此基础上研发出的以蜂毒肽为“弹头”的抗毒素，对前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等都具很好的疗效。2008年，姬聪慧以Melittin为毒性部分，RGD(精一甘一天冬氨酸三肽)为靶向部分，通过基因重组融合表达，构建了膜毒性免疫毒素RGD—Mel，在体外表现出明显的抗肿瘤活性。

与传统抑癌药物结合带来的疗效

常见的化疗药物有很强的非靶向毒副作用和产生耐药性，因此有科学家尝试通过传统抗癌化疗药物与具有膜活性的阳离子两亲性细胞毒肽结合达到降低各自使用剂量，既能增加抗肿瘤效果和降低毒副作用，同时避免耐药性问题。与蜂毒肽类似的阳离子两亲性肽如天蚕素抗菌肽与抗癌药物氟尿嘧啶及S一阿糖胞苷、蛙皮素类似物与顺铂、阿霉素和依托泊苷协同作用都显示了增强抗肿瘤作用和减少或避免耐药性问题。

2006年，王居祥等报道，将蜂毒注射液与化疗相结合，观察患者近期客观疗效、临床证候改善情况和对生活质量的影响，结果在改善临床证候方面，联合治疗组的作用优于单纯化疗组与蜂毒注射液组。

应用微纳米药物传递系统

2001年，凌昌全等报道，将蜂毒素——泊洛沙姆407缓释剂注入H22荷瘤小鼠瘤体内，结果证明蜂毒素缓释制剂的毒性明显低于单纯蜂毒素，且治疗后平均生存期明显延长，综合疗效优于单纯蜂毒素组。表明蜂毒素的缓慢释放延长了其对肿瘤细胞的作用时间，增强了抗肿瘤效应，同时减轻了蜂毒素对机体的毒性，表现出明显的减毒增效作用。

2004年，李琦等报道，采用改良的复乳-液中干燥法制备蜂毒素——聚乳酸羟乙酸微球，介入治疗大鼠移植性肝癌，药物在肿瘤局部缓慢释放，局部药物浓度高，全身浓度低，蜂毒素微球在抑制肿瘤生长，延长荷瘤大鼠生存时间方面明显优于蜂毒素和空白微球，起到了很好的减毒增效作用，但其使用的是肝动脉插管法给药，需要剖腹。

2008年，苏永华等制备蜂毒素磁性纳米制剂并作用于小鼠H22移植肿瘤，结果显示蜂毒素磁性纳米制剂对小鼠肝癌皮下瘤模型有明显的抗肿瘤作用。2011年，代坤坤等报道以全氟碳为纳米核心，通过高压均质法制备蜂毒素纳米囊，用于蜂毒肽减毒增效抗肿瘤研究。2011年，钟铁诚等报道了，制备载有蜂毒素的磷酸钙纳米粒用于体外抑瘤活性的研究，其释放行为具有酸敏性特点，缓释作用提高了抑瘤活性。

另外，华盛顿大学医学院的Wickkline SA等相关课题组近几年做了以蜂毒肽为代表的阳离子两亲性肽(Cytolytic peptides)减毒增效的一系列研究。该课题组制备的非靶向和整合素αvβ3靶向的全氟化碳纳米粒子装载蜂毒肽(melittin NP and αvβ3-targeted melittin NP)与单纯蜂毒肽相比，明显的降低了其对小鼠体内血细胞的溶血作用，延长了在血液中的循环时间，同时避免蜂毒肽被降解和非靶向副作用，增加了传递到肿瘤细胞的浓度和增强了抑制肿瘤生长的作用。

在此基础上他们还发明了一种两亲性肽链接器，该链接器本身是一个被截断缺失部分氨基末端的蜂毒肽片段(VLTTGLPALISWIKRKRQQ-ggVHPKQHR)，其保留膜结合性，但不具有溶解细胞性，可快速将anti-VCAM靶向肽段(靶向血管细胞粘附因子)连接到全氟化碳纳米粒子(单层脂质传递系统)和脂质体(双层脂质传递系统)药物载体表面，靶向新生血管或癌细胞，用于针对特定病理的人或特定病例阶段灵活和个性化定制药物运输系统。

进一步研究和完善早日造福人类

根据研究蜂毒肽虽有抗肿瘤作用，但对于具体的抗肿瘤机制还没有一个定论。蜂毒肽本身具相对分子质量小、结构较简单，没有现今的一些抗癌药物毒副作用强，且不易产生耐药性等特点，为低毒或无毒副作用的抗肿瘤新药研发提供了有利的条件。另一方面，其仍存在的毒副作用和较差的药代动力学阻碍了其抗肿瘤临床应用的开展，为了改善药代动力学性能，降低其毒副作用，科学家们都进行了相关尝试。

通过化学或基因重组的方法改变蜂毒肽的结构、与其他化疗药物相结合和应用各种新型的微纳米药物运输系统靶向肿瘤组织或肿瘤细胞，以达到减毒增效和减少或避免产生耐药性。这些尝试较传统的化疗治疗癌症有了一定的进步性，但目前很多局限于细胞水平或在鼠体内进行研究。虽然研究显示在改善药代动力学，延长在血液中的半衰期，降低其非靶向性毒副作用，增强其抗肿瘤效应，都取得了很好的效果。但蜂毒肽及药物传递体系在其他活体体内包括人体内的作用，如药代动力学，生物相容性，可降解性，是否有潜在的毒副作用等方面需要进一步的研究和完善，以期早日造福人类。另外，通过基因重组的方式获得具有靶向性的改性蜂毒肽或结合基因治疗，以此降低蜂毒肽的溶血作用和非靶向毒性，同时避免耐药性问题，仍然是未来研究蜂毒肽抗肿瘤很好的方向。

[1] 杨文超.蜂毒肽的分离纯化及其抗辐射作用机理研究[D].福建农业大学硕士学位论文 2007.

[2] 张丽娟.蜂毒肽分离纯化与体内外抗HSV-1病毒作用的研究[D].福建农业大学硕士学位论文，2010.