2009～2011年上海市手足口病流行病学和病原学特征

邵俊杰，王嘉瑜，滕峥，潘浩，陈洪友，匡小舟，俞雪莲，朱兆奎，张曦

上海市疾病预防控制中心, 上海 200336

手足口病 (hand, foot and mouth disease, HFMD)是婴幼儿常见传染病，临床表现以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹、溃疡等为主，个别患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等致命并发症[1,2]。手足口病是世界范围内流行的传染病[3]，近10年来许多国家和地区均有此病暴发或流行的报道，已引起普遍关注。手足口病可由多种肠道病毒引起，其中人肠道病毒71型(human enterovirus 71，HEV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16，CA16)为主要病原体。

2008年5月，我国将手足口病纳入丙类法定传染病报告与管理。同年，上海市开展对手足口病常规监测，并于2009年建立各区(县)手足口病监测网络实验室。 本研究对上海市2009～2011年手足口病的流行病学资料、手足口病监测网络实验室数据进行分析和总结；对3年内分离获得的部分HEV71毒株的VP1基因序列进行分析，以初步阐明本市手足口病的流行病学及病原学特征，为本市手足口病预防和控制策略的制定提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 流行病学资料

流行病学分析所用数据来源于国家疾病监测信息报告管理系统。

1.2 标本

收集2009～2011年上海市18个区(县)手足口病监测网络实验室采集的手足口病病例临床标本共6 676份(2009年徐汇区、黄浦区、长宁区无送检标本)，其中2009年799份、2010年2 902份、2011年2 975份。

1.3 核酸提取及检测

咽拭子或疱疹液标本经1 500g离心10 min后，取200 μ l上清液用于核酸提取。使用NucliSens SCNS(梅里埃公司，法国)核酸抽提试剂提取核酸，在待检标本中加入400 μ l 裂解液，室温孵育10 min 后加入65 μ l磁珠，上机提取核酸。程序设置按照仪器说明书进行。

使用肠道病毒通用荧光定量反转录聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测试剂盒、HEV71 荧光定量RT-PCR 检测试剂盒和CA16 荧光定量RT-PCR 检测试剂盒(上海之江生物科技股份有限公司)对所有样品进行检测。扩增反应体系和条件按照说明书操作和设置，在Roche LightCycler 480型荧光定量PCR仪上进行。

1.4 病毒分离

将2009～2011年上送的257份HEV71核酸阳性标本接种于正常生长的人横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RD)细胞，镜下逐日观察细胞病变情况，对未发生细胞病变的标本盲传2代。将发生细胞病变的培养物冻融3次，离心后取上清液，用HEV71 荧光定量RT-PCR 检测试剂盒进行毒株鉴定。

1.5 基因扩增及序列测定

从2009～2011年分离获得的HEV71阳性毒株中，选取27株(2009年7株、2010年10株、2011年10株)进行VP1编码区序列测定，用于HEV71基因特征分析。 引物采用中国疾病预防控制中心设计的VP1基因全长(891 bp)，上游引物：5′ -GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3′ ，下游引物：5′ -AAGTCGCGAGAGCTGTCTTC-3′ 。 扩增反应采用Invitrogen公司的SuperScriptTMIII One-Step RT-PCR System with Platinum®Taq High Fidelity试剂盒，具体操作参照说明书。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳确认后进行测序和分析(测序由上海博尚生物技术有限公司完成)。

1.6 序列分析

将本研究中27条HEV71 VP1序列与GenBank下载的不同基因型/亚型HEV71代表株的VP1序列进行同源性及基因进化关系分析，采用Vector NTI生物信息软件进行序列拼接分析、同源性比对，亲缘性关系树采用MEGA5.05软件进行构建。

2 结果

2.1 流行病学

2.1.1疫情概况2009～2011年上海市累计报告手足口病102 756例，重症968例，占病例总数的0.94%；死亡19例。其中，2010年上海市手足口病报告41 151例，发病率为214.22/10万，较2009年上升68.68%；重症418例，上升113.27%；死亡11例，均为3年中最高值(表1)。

表1 2009～2011年上海市手足口病流行病学概况

Tab.1 Epidemiological characteristic of HFMD cases in Shanghai, 2009-2011

YearCases Severe casesDeathMorbidity(/100 000)Fatality rate(%)200924 2821966128.590.025 201041 15141811214.220.027 201137 3233542162.140.005

2.1.2地区、时间分布2009～2011年上海市18个区(县)均有手足口病病例报告，3年内发病数居前3位的是浦东新区20 127例、闵行区16 012例及宝山区7 705例。

就发病时间来看，2009年发病高峰期为4～7月，此期报告病例数占全年病例数的48.97%，11月出现第2个发病小高峰，病例数占10.46%。2010年发病集中在4～6月，其中5月最高，峰值较2009年明显上升。2011年发病高峰期较2010年推迟约1个月，主要集中在6～7月，峰值亦明显降低。

2.1.3人群分布主要发病年龄为≤5岁的婴幼儿，其次为6～7岁学生。2009年≤5岁婴幼儿占发病人数的84.2%，2010年和2011年分别占93.1%和91.8%。其中，2009年以2岁组幼儿发病数最高，占26.8%；2010和2011年均以1岁组幼儿发病数最高，分别占24.8%和24.5%。职业分布以散居儿童、幼托儿童为主。性别分布以男性为主，男女性别比为1.6∶1。

2.2 病原构成

2.2.1不同地区的病原构成对2009～2011年上海市18个区(县)手足口病监测网络实验室6 676例病例标本进行实验室诊断(2009年徐汇区、黄浦区、长宁区无送检标本)，4 647例病例标本核酸检测为肠道病毒阳性，阳性率为69.61%。3年间上海市HEV71和CA16阳性检出率分别为38.83%和21.26%。除虹口区、普陀区、闸北区以CA16为主外，崇明县HEV71与CA16构成比相当，其他区(县)均以HEV71为主(表2)。

表2 2009～2011年上海市18个区(县)手足口病病例病原构成

Tab.2 Pathogen constituent of HFMD cases in Shanghai, 2009-2011

District/CountyCases Positive cases (n,%)Constituent ratio (n,%)HEV71CA16Other HEVBaoshan326235(72.09)141(60.00)70(29.79)24(10.21)Changning686486(70.85)246(50.62)140(28.81)100(20.58)Chongming276183(66.30)71(38.80)70(38.25)42(22.95)Fengxian297214(72.05)103(48.13)59(27.57)52(24.30)Hongkou248152(61.29)55(36.18)68(44.74)29(19.08)Huangpu177123(69.49)61(49.59)24(19.51)38(30.89)Jiading213182(85.45)90(49.45)64(35.16)28(15.38)Jing’an454328(72.25)160(48.78)124(37.80)44(13.41)Jinshan177141(79.66)59(41.84)56(39.72)26(18.44)Luwan296186(62.84)111(59.68)72(38.71)3(1.61)Minhang1 2861 027(79.86)834(81.21)125(12.17)68(6.62)Pudong310205(66.13)106(51.71)86(41.95)13(6.34)Putuo470282(60.00)107(37.94)150(53.19)25(8.87)Qingpu423187(44.21)125(66.84)59(31.55)3(1.60)Songjiang171128(74.85)55(42.97)44(34.38)29(22.66)Xuhui318234(73.58)101(43.16)89(38.03)44(18.80)Yangpu332241(72.59)136(56.43)60(24.90)45(18.67)Zhabei216113(52.32)31(27.43)59(52.21)23(20.35)

2.2.2不同年份的病原构成对不同年份的病原构成情况进行统计，结果表明，2009年手足口病人肠道病毒通用型核酸阳性比例最高，为75.97%，2010和2011年分别为68.71%和68.77%。从HEV71检出率来看， 2011年HEV71核酸阳性的检出率为41.34 %，高于2009年的38.67%和2010年的36.29%。CA16核酸阳性的检出率从2009年的33.54%降至2011年的16.40%，呈逐年下降的趋势(图1)。

图1上海地区2009～2011年手足口病各病原阳性检出率

Fig.1 Detection rate of pathogen in Shanghai, 2009-2011

2.3 病毒分离结果

将257例HEV71核酸阳性标本接种细胞传代后，获得阳性毒株57株(图2)，病毒分离阳性率为22.18%。

2.4 HEV71基因特征分析

在2009～2011年分离获得的HEV71阳性毒株中，选取27株进行HEV71的VP1基因片段扩增(电泳结果见图3)，大小为927 bp。测序后获得的VP1基因片段通过Vector NTI软件对比标准VP1序列剪接后，得到的序列均为891 bp，用于对基因序列分析。

从GenBank上下载A基因型(GenBank号：BrCr/USA/87)、B1基因型(GenBank号：6910/USA/87、Nagoya/JPN/1973)、B2基因型(GenBank号：2952/USA/81、7423/USA/1987)、B3基因型(GenBank号：SK-EV006-SAR/MAS/97、4F/AUS/4/99)、B4基因型(GenBank号：2027/SIN/01、C7-Osaka/JPN/1997)、B5基因型(GenBank号：SB12007-SAR/MAS/03、SB12282-SAR/MAS/03)、C1基因型(GenBank号：0915/USA/87、SB9508-SAR/MAS/03)、C2基因型(GenBank号：8M/AUS/6/99、2641/AUS/95)、C3基因型(GenBank号：03/KOR/00、97-56/HLJ/CHN/97)、C4a基因型(GenBank号：521-09F/SD/CHN/07、521-19T/SD/CHN/07)、C4b基因型(GenBank号：H25/SH/CHN/00、H26/SH/CHN/00)及国内部分地区代表株的VP1序列，作为参考序列进行基因分析。

A: Control RD cells. B: Cells infected with HEV71.

图2 HEV71引起RD细胞病变

Fig.2 Cytopathic effect of RD cells induced by HEV71

A: From left to right: scdc01/sh/chn/2009, scdc02/sh/chn/2009, scdc03/sh/chn/2009, scdc04/sh/chn/2009, scdc05/sh/chn/2009, scdc06/sh/chn/2009, scdc07/sh/chn/2009, scdc01/sh/chn/2010, scdc02/sh/chn/2010, scdc03/sh/chn/2010, scdc04/sh/chn/2010, scdc05/sh/chn/2010, scdc06/sh/chn/2010, scdc017sh/chn/2010, and marker. B: From left to right: scdc08/sh/chn/2010, scdc09/sh/chn/2010, scdc10/sh/chn/2010, scdc01/sh/chn/2011, scdc02/sh/chn/2011, scdc03/sh/chn/2011, scdc04/sh/chn/2011, scdc05/sh/chn/2011, scdc06/sh/chn/2011, scdc07/sh/chn/2011, scdc08/sh/chn/2011, scdc09/sh/chn/2011, scdc10/sh/chn/2011 and marker.

图3 VP1基因扩增电泳结果

Fig.3 Electrophoresis results of product amplified by primer VP1

从MEGA5.05生物信息学软件构建的基因进化树(图4)可看出，上海市27株HEV71与C4a 亚型毒株聚为一簇，具有最近的进化亲缘性。本研究中27个VP1基因核苷酸同源性为95%～100%，氨基酸同源性为98%～100%。与国内其他省市代表株(核苷酸同源性为94%～100%，氨基酸同源性为97%～100%)相比，未发现特征性差异。

图4基于VP1核苷酸序列(891 nt)构建的上海HEV71与各基因型/亚型的亲缘性关系树

Fig.4 Phylogenetic tree reconstructed from HEV71 strains from Shanghai and representatives of each genotype/subgenotype, based on nucleotide acid sequences of VP1-coding region (891 nt)

3 讨论

手足口病是肠道病毒引起的婴幼儿常见病，其最主要的病原体是HEV71型和CA16型，少数病例可由CA4、CA5、CA7、CA9、CA10、CB5、CB6型引起[4-9]。近年来，在亚太地区不断有手足口病暴发流行[10]，且呈上升趋势。自1969年首次分离到HEV71以来[11]，由于其感染宿主后更易侵犯神经系统而导致重症及死亡病例[12]而越来越受到各方关注。自1981年上海报道手足口病以来[13]，各省市每年均有散发、暴发病例。2008年安徽阜阳暴发的手足口病疫情引起社会各界广泛关注，卫生部将手足口病列入法定丙类传染病进行监管，上海市于2009年建立手足口病防控与监测网络。本研究通过对2009～2011年上海地区手足口病流行病学及病原学结果进行分析，以了解上海地区手足口病流行规律及特点。

与以往研究相似[14]，2009～2011年上海市发生的手足口病病例男性多于女性，主要以0～5岁婴幼儿为主，多发于散居及幼托儿童。因此，该年龄段儿童应列为手足口病防控的主要对象，也是防止手足口病发展为重症、死亡病例的重点人群。从区域分布来看，3年内发病数居前2位的分别是浦东新区和闵行区，这可能与这些区存在大型儿童医院相关。

对3年来上海市18个区(县)6 676例手足口病病例进行实验室诊断，结果显示2009～2011年造成上海地区手足口病流行的主要病原仍为HEV71和CA16。值得关注的是，HEV71感染的病例呈上升趋势，2011年HEV71检出率高于2009及2010年，这也与HEV71感染存在隔2年出现高发的特点相符[15]，但其原因有待进一步研究。此外，由于HEV71感染后易侵犯中枢神经系统并导致重症及死亡病例，上海地区手足口病的防控形势依然严峻。CA16感染的病例数呈逐年下降趋势，而其他肠道病毒致手足口病病例的构成逐年上升，提示对其他肠道病毒的鉴定与分型有助于手足口病防控工作的开展。对不同区(县)HEV71和CA16检出率的比较发现，虹口区、普陀区、闸北区以CA16感染为主, 崇明县两者比例相当，其余区(县)以HEV71感染为主(表2)，提示必须同时对HEV71和CA16采取监测和控制措施，才能切实开展好手足口病的防控工作。

此次研究分析的27株HEV71 VP1基因核苷酸序列的同源性为95%～100%，氨基酸同源性为98%～100%，均非常接近国内C4a流行株，与其有非常高的同源性，证实上海市2009～2011年流行的HEV71为C4a亚型。本研究与周边省市[1,16-18]流行株相同，而与国外[2,19-21]研究结果比较，流行株不尽相同，说明国内手足口病存在稳定优势株。目前国内HEV71主要以C4a流行株为主[22-26]。

由此可见，肠道病毒引起的手足口病已成为上海及国内其他省市婴幼儿常见病，发病率较高，HEV71和CA16仍为主要病原体。对其进行流行病学监测和病原体检测有助于了解本地区流行株型别及流行株变异对疾病流行的影响，从而对疾病进行更加有效的防控。

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