不育患者精液的氧化应激对精子DNA完整性等参数的影响

焦瑞宝，冯恒孝，唐吉斌，方军，凤俊蓉，詹三华，周萍，陈然

(1.铜陵市人民医院临检中心，安徽铜陵244009;2.铜陵市人民医院中医男科，安徽铜陵244009;3.铜陵市人民医院泌尿外科，安徽铜陵244009;4.铜陵市人民医院不孕症科，安徽铜陵244009;5.铜陵市人民医院药剂科，安徽铜陵244009)

世界卫生组织统计显示，发达国家约有5% ～8%的夫妇受到不孕症的影响，有的非洲国家不孕症的患病率可高达30%，我国约为1% ～5%。不孕不育发病率有逐年上升的趋势，男方因素约为一半。而引起男性不育症的原因很多，比如精神压力、吸烟酗酒、环境污染、生活方式改变等。近年来国内、外研究证实［1-2］，精液的氧化应激(oxidative stress，OS)是造成男性不育的重要原因之一。

在生殖系统中，少量持续的活性氧(reactive oxygen species，ROS)是精子受精、获能等生理过程所必需的，起了重要作用。精液中活性氧的来源有两种:(1)人类精液中多形核白细胞(WBC)具有很强的ROS生成能力;(2)精子自身，精子线粒体呼吸链上的一系列氧化反应产生的，在正常情况下通过自氧化一种或多种还原物质释放少量的活性氧;另外一种途径是存在精子膜上的还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶与其底物反应生成ROS［1］。当生殖道出现感染等情况时，作为第一道防御机制的中性粒细胞∕巨噬细胞吞噬病原微生物，代谢旺盛，产生过多的ROS。附睾是精子成熟和储存的部位，也是生殖道中保护精子对抗氧化损伤的重要部位，多种抗氧化物和抗氧化酶的mRNA分布于附睾中［1］。本研究旨在全面分析男性不育精液的氧化应激反应对精子动态参数、形态参数、功能参数精子DNA完整性等的影响，探讨其作用机制。

材料和方法

一、研究对象

选择2011年9月至2011年12月在铜陵市人民医院中医男科、泌尿科以及不孕症门诊就诊的92例男性不育患者，排除无精子症、精液量过少(＜0.5 mL)、精液部分丢失者以及资料不全的患者11例，余下81例作为研究对象(排除女方因素)，患者年龄20～35岁，身体健康，无睾丸外伤、家族遗传性疾病史及性功能障碍病史，无不良生活习惯(如烟酒等嗜好)，体检睾丸、附睾及输精管无明显异常。21名健康对照组来源于本院年轻职工，年龄25～30岁，妻子刚怀孕满12周至孩子出生未满1周岁的男性医务人员作为健康对照组。

二、仪器及试剂

1.计算机辅助精子动态、形态分析系统由南京大学捷达软件工程有限公司提供;721可见分光光度计由上海元析仪器有限公司提供;BX41型荧光显微镜为OLYMPUS公司产品;KDC-40低速离心机由安徽中科中佳科学仪器有限公司生产。

2.微量丙二醛(MDA)检测试剂盒、总抗氧化能力试剂盒由江苏南京建成生物工程研究所生产提供;精子核吖啶橙(AO)染色试剂盒、精子膜检测(低渗肿胀法)试剂盒、精液WBC过氧化酶染色(正甲苯胺法)试剂盒、精子形态(Diff-Quik)快速染色试剂盒均由深圳华康生物医学工程有限公司生产提供。

三、实验方法

1.精液标本采集 所有研究对象按照《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》(以下简称5版)［3］要求在取精前禁欲3至5 d，至少禁欲48 h，手淫法采集精液于干燥无菌取精杯中，要求在实验室附近取精室留取，或者在家里留取要求保温(25～30℃)，在1 h内送至实验室。

2.精液动态分析 按5版要求严格操作，将送来的精液标本置37℃水浴箱中，观察液化状态，取充分混匀的精液5 μL置于计算机辅助精子动态分析系统上进行精子质量参数分析，并记录检测结果。

3.精子形态学分析、精子膜低渗膨胀试验、精液WBC过氧化酶正甲苯胺染色试验 按5版推荐Diff-Quik快速染色法和 Kruger等［3］标准，在计算机辅助精子形态分析系统上分析200个精子形态。在MACRO精子计数盘中，计算200个精子中肿胀精子的百分率。涂片在高倍镜下观察，其中，棕色细胞为过氧化酶阳性细胞，而过氧化酶阴性细胞不着色，用精子专用计数板计数棕色细胞浓度。

4.精液微量MDA测定 精子膜脂类过氧化反应的程度以反应产物MDA的产量表示，MDA测定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法。取待测精液0.1 mL为测定管，并设测定空白管，以及标准管及标准空白管，严格按照说明书操作，分别加入试剂。直接测得原始MDA后需要修正，修正MDA是将精子浓度高于20×106/mL的患者调整为20×106/mL，目的是为了排除由于过多精子自身产生MDA的影响，通过换算得到后的浓度［4］。修正MDA的计算公式=原始MDA÷(精子浓度/20×106/mL)。

5.精液总抗氧化能力(TAC)测定 精液中有许多抗氧化物质，包括酶促与非酶促体系，均能使Fe3+还原成Fe2+，而与Fe2+菲啉类物质形成稳定的络合物，反应设定空白对照管，通过比色可测定出其抗氧化能力的高低。其中，1个总抗氧化能力单位定义是在37℃，每分钟每毫升血清(浆)使反应体系的吸光度(A)值每增加0.01时，为1个总抗氧化能力单位。具体实验操作参见试剂盒使用说明书。氧化应激指数(OSI)是评价男性不育患者精液内活性氧与抗氧化之间的动态平衡的，是在权衡活性氧指标对精子膜伤害以及精液自身抗氧化系统的状态指数［5］，计算公式OSI=修正后MDA/TAC×100%。

6.精子DNA完整性的检测 精液液化并计数，取液化精液1.0 mL加于离心管内，1 000×g离心5 min，去除精浆，加1 mL稀释洗涤液，充分混匀。500×g离心5min，去上清液，如此共洗涤3次;最后1次洗涤完毕，弃上清液，用稀释洗涤液调整精子浓度为20×106/mL。取5～10 μL悬浮液于清洁载玻片上涂片，晾干，滴加数滴乙醛固定液固定10 min，后将玻片直立于吸水纸上以除去固定液;滴加数滴新鲜配制的吖啶橙工作液染色5 min，流水冲洗，晾干;荧光显微镜(OLYMPUS—BX41)观察(激发滤光片波长460～490 nm)，每个视野观察时间不超过40 s。利用AO异染性，AO与双链DNA结合发出绿色荧光，与单链DNA结合发出红色或黄色荧光，计数200个精子中绿色、红色和橙黄色精子数。计算出红色、橙黄色荧光精子的百分率，即为精子DNA碎片化指数(DNA fragmentation index，DFI)，精子 DNA 完整性 =1-DFI。

四、统计学方法

结 果

将81例男性不育患者的活性氧指标MDA按原始检测结果划分:＜5 nmol/mL为30例，5～＜10 nmol/mL为21例，10～＜15 nmol/mL为16例，15～＜20 nmol/mL为5例，≥20 nmol/mL为9例;TAC按检测结果划分:＜10 U/L为3例，10～＜15 U/L为13例，15～ ＜20 U/L为16例，20～＜30 U/L为23例，≥30 U/L为26例。

将81例男性不育患者按精液分析的结果分为:少精症组(精子浓度＜15×106/mL)共5例;活力Ⅰ组为弱精子症组［即精子前向运动(PR)＜32%］共31例;活力Ⅱ组为前向运动精子32% ＜PR＜50%组共25例;活力Ⅲ组为前向运动PR＞50%组共11例;WBC精子症组(简称为白精症组，即精液WBC计数＞1×106/mL)共9例;另设健康对照组21名。各不育组与对照组的参数比较见表1。

表1 81例男性不育患者和21名健康对照组精液参数的比较

各病例组修正后MDA与健康对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05或0.01);随着精子活力下降，精子MDA呈增加趋势;且活力Ⅰ组、活力Ⅱ组、活力Ⅲ组MDA浓度分别与少精症组、白精症组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。各组TAC值，与健康对照组TAC比较差异有统计学意义(P＜0.01);活力Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组3组之间比较，差异无统计学意义;少精症组、白精症组与其他3组病例组比较，差异无统计学意义，但呈下降趋势。

OSI与各精液参数的相关性分析见表2。

表2 OSI与精子分析参数的相关性分析

讨 论

1979年 Jones等［6］首次提出，人类精子对氧化应激特别敏感，氧化应激可能是造成男性不育的一个重要原因。人类精子膜含有高浓度的不饱和脂肪酸，并具有多个双键，这些双键是维持精子膜流动性所必需的，脂质对受精过程中精卵识别和膜的融合、精子与顶体的融合及精子膜上去能物质的清除都有十分重要作用。由于高浓度不饱和脂肪酸极易受自由基的攻击，这对精子本身又构成了一种潜在的危险。在氧自由基的攻击下，精子膜的不饱和脂肪酸发生脂类过氧化反应，使脂肪酸失去双键，进而使精子膜失去流动性，最终导致精子功能障碍和男性不育。MDA是不饱和脂肪酸代谢终产物之一，其生成量可反映精子膜的脂类过氧化程度。

在精子发生过程中，各级生精细胞核内与DNA结合的蛋白随着DNA含量的规律变化而变化，经历组蛋白到过渡蛋白再到鱼精蛋白的组型转换。成熟的精子，其DNA与精核蛋白(主要是鱼精蛋白)之间存在着独特结合方式，DNA链紧密缠绕鱼精蛋白分子，形成紧密且高度有序的环，使精子染色质高度紧密完整，从而能保护精子基因免受外部应激状态损伤。精子染色质结构分析法(SCSA)原理是受损DNA在酸作用下变性为单链，利用AO异染性，AO与双链DNA结合发出绿色荧光，与单链DNA结合发出红色或黄色荧光。AO荧光染色后，核完整性评估在荧光显微镜和流式细胞仪下均能完成，两者原理一致。但与荧光显微镜相比，在流式细胞仪下观察染色后精子DNA变化更加详细准确，易标准化，且具有较高可复性、明确的临床应用价值，被认为是精子染色质完整性检测的“金标准”［7］。

活性氧、氧化应激与男性不育症之间的关系，近来得到男科以及生殖医学界广泛关注。本项目研究为了避免精液离心和冷冻复苏对精液活性氧指标 MDA 影响，借鉴国外专家建议［1，5］采用新鲜精液测定原始MDA含量，同时采用将原始精子浓度＞20×106/mL换算为20×106/mL得出换算系数，计算排除精子浓度过高由精子自身产生的活性氧带来影响，得到修正后MDA水平。修正后MDA含量随着精子活力的下降，精子MDA呈现增加的趋势;而且活力Ⅰ组，活力Ⅱ组，活力Ⅲ组的MDA浓度分别与少精症组、白精症组比较，差异均有统计学意义(P＜0.01);说明精液内过多活性氧存在导致精子膜发生脂质过氧化反应产生MDA，破坏精子膜结构的完整性，引起精子运动能力下降，引起精子正常形态率降低。而TAC测定采用精浆，不受精子浓度的影响，相对比较稳定。

近年来，国外多位专家［1，5］倡导新指标—OSI评价精液氧化应激水平，应用精子活性氧与TAC比值来换算得到，该指数兼顾活性氧含量、TAC之间变化因素。研究显示，精液OSI与精子浓度及总数、MDA含量以及核DNA碎片化指数(DFI)成正相关，且差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);OSI与精子活率、PR、VAP、VSL、HOS、快速直线运动精子浓度及总数、TAC以及正常形态率呈负相关，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。与毛毳等［8］开展的体外人工试验有相似之处。生殖系统如急慢性炎症、细菌、支原体和衣原体等感染，多种疾病、不良生活习惯等均可引起局部氧自由基增加导致精液的氧化应激反应，氧化应激会导致精子膜完整性降低，精子运动能力下降，正常形态率下降［9］。精子DNA核酸含有亲核基团，活性氧自由基能与其碱基反应使DNA链聚集，改变DNA正常结构，造成DNA链断裂，也通过脂质过氧化作用影响DNA，引起超氧化物歧化酶(SOD)基因表达变化，使合成减少，核DNA碎片化指数上升［10］。

氧化应激反应是近来受到较多关注男性不育病因之一，由于各种因素引起活性氧产生过多，TAC的下降，精液发生氧化应激反应，可造成精子动态参数、形态参数，以及功能参数的改变。这些改变可能是氧化应激反应引起男性不育的重要机制之一。

［1］Hammadeh ME，Al Hasani S，Rosenbaum P，et al.Reactive oxygen species， total antioxidant concentration of seminal plasma and their effect on sperm parameters and outcome of IVF/IC SI patients［J］.Arch Gynecol Obstet，2008，277(6):515-526.

［2］Tunc O，Thompson J，Tremellen K.Development of the NBT assay as a marker of sperm oxidative stress［J］.Int J Androl，2010，33(1):13-21.

［3］世界卫生组织.人类精液检查与处理实验室手册［M］.第5版.北京:人民卫生出版社，2011:53-86.

［4］陈俊清，罗胜萍，黄诚刚.精浆活性氧水平与男性不育的相关性研究［J］.国际检验医学杂志，2011，32(9):1002-1004.

［5］Agarwal A，Makker K，Sharma R.Clinical relevance of oxidative stress in male factor infertility:an update［J］.Am J Reprod Immunol，2008，59(1):2-11.

［6］Jones R，Mann T，Sherins R.Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa，spermicidal properties of fatty acid peroxides，and protective action of seminal plasma［J］.Fertil Steril，1979，31(5):531-537.

［7］陈建伟，张晓霞，崔 云.双尾彗星实验检测精子DNA完整性的方法学建立［J］.检验医学，2012，27(1):21-25.

［8］毛 毳，张 丹，王成芳，等.氧化应激性损伤对不育男性精子功能的影响［J］.四川大学学报(医学版)，2010，41(4):723-724.

［9］何 江，余伍忠，邹红云，等.吸烟对男性不育患者精子活力和动态参数的影响及相关性研究［J］.检验医学，2011，26(4):217-221.

［10］Dada R，Shamsi MB，Venkatesh S，et al.Attenuation of oxidative stress＆DNA damage in varicocelectomy:implications in infertility management［J］.Indian J Med Res，2010，132:728-730.