白细胞介素-18基因启动子多态性与鼻咽癌遗传易感性的研究

潘国刚， 罗 斌，滕元姬，梁丽娜

(右江民族医学院附属医院检验科，广西百色533000)

鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种多基因、多因素综合作用而导致的一种常见疾病，然其病因和发病机制尚未完全阐明，但遗传基因在鼻咽癌发病过程中可能起着重要的作用，随着人类基因组计划的迅速发展，NPC相关基因的定位和识别已成为研究的热点。白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)是一种多效性细胞因子，主要由激活的单核巨噬细胞产生，可诱导γ-干扰素 (interferon-γ，IFN-γ)产生，参与了多种疾病病理过程，在感染、免疫调节、肿瘤发生中的作用受到广泛关注［1-2］。近年对IL-18基因多态性与疾病的关系有较多研究报道。但是，IL-18在肿瘤发生和进程中的分子机制还尚未完全阐明。IL-18基因位于11号染色体长臂上(11q22.2-q22.3)，由6个外显子和5个内含子组成，分子生物学研究表明IL-18基因存在着单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)。这种基因多态性与人类多种肿瘤、霍奇金病及自身免疫性疾病的关系［3-5］已成为国内、外学者研究的热点。目前，有关IL-18基因多态性与NPC关系的研究国内较少文献报道。为此，我们采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)的方法，研究IL-18基因多态性及单倍型与NPC的关系，为认识NPC的发病机制提供一定的理论依据。

材料和方法

一、研究对象

全部NPC来自于右江民族医学院附属医院住院的患者，全部研究对象均经病理证实，共190例，其中男135例，女55例，年龄(48±8)岁;选择年龄、性别相匹配的200名无血缘关系的同期正常健康体检者为对照组，其中男140名，女60名，年龄(47±8)岁。全部研究对象均为广西籍人。该研究获得右江民族医学院附属医院伦理委员会批准，且以上标本采集均由本人知情同意。

二、研究方法

1.基因组DNA提取 采集静脉血3mL，用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝;采用改良碘化钠法提取白细胞基因组DNA，-70℃保存备用。

2.PCR扩增 参照Genbank公布的序列(NT033899.7)设计2对引物，由上海英俊有限公司合成。(引物序列的起止位置为:-655位点至-519位点)用于特异性扩增IL-18基因包含-607位点的一段 DNA引物序列，上游引物为:5'-CCCTCTCCCCAAGCTTACTT-3';下游引物为:5'-TTCAGTGGAACAGGAGTCCA-3';(引物序列的起止位置为:-366位点至-111位点)用于特异性扩增IL-18基因包含-137位点的一段DNA引物序列，上游引物为:5'-TTGTAACATTGTAGGAATTACC-3';下游引物为:5'-ATGTAATATCACTATTTTCATGAGA-3'，IL-18的PCR扩增反应体系均为25 μL，其中含 10 ×PCR 缓冲液 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各 20 pmoL，模板 DNA 2.0 μL，TaqDNA 聚合酶1.25 U，不足体积用灭菌双蒸水补足至25 μL。置热循环仪(Bio-Rad)中94℃预变性5 min;再按下列程序循环35次，即94℃变性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸55 s;末次循环后，72℃延伸5 min。

3.扩增产物的限制性酶切 取PCR扩增产物3 μL，分别用2 U限制性内切酶Mse I和BfuC I(英国Biolabs公司)酶切IL-18基因-607和-137位点，37℃孵育3h，反应终止后，消化片段在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，EB染色，染色后通过凝胶成像系统判断结果。

三、统计学方法

用SPSS11.5软件包进行分析。基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算，研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度及各组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，并以比值比(odds ratio，OR)及其95%可信区间(confidence interval，CI)表示相对风险度。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、IL-18基因型检测结果

IL-18基因-137 G/C多态性，PCR扩增产物片段大小为256 bp，根据限制性内切酶BfuC I酶切片段的情况，检测到基因型有3种，CC型(256 bp 1条带)，GC 型(256 bp，229 bp和27 bp 3条带)，GG型(229 bp和27 bp 2条带)，见图 1;IL-18基因-607 C/A多态性，PCR扩增产物片段大小为137 bp，根据限制性内切酶Mse I酶切片段的情况，检测到基因型有3种，AA型(91 bp，46 bp 2条带)，CA 型(137 bp，91 bp和46 bp 3条带)，CC型(137 bp 1条带)，见图2。为验证基因型结果，PCR产物直接测序结果与Genbank参照序列(NT033899.7)相一致，见图3～4。

二、NPC与对照组IL-18基因多态性的比较

IL-18基因型在2组人群中分布频率，经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，2组均达到遗传平衡，具有群体代表性。经χ2检验及相关分析，IL-18-137位点等位基因频率在2组人群中的分布差异有统计学意义(χ2=9.895，P＜0.05);等位基因频率的相对风险分析发现，C等位基因携带者患NPC的风险是G等位基因的1.730倍(OR=1.730，95%CI:1.227～2.439);IL-18 基因-607 C/A多态性在2组人群中的分布差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

三、NPC组与对照组IL-18基因的连锁不平衡及单倍型分析

应用单倍型SHEsis分析软件对IL-18基因-137 G/C和-607 C/A这2个位点的单核苷酸多态性进行连锁不平衡分析，结果显示IL-18基因-137 G/C与-607 C/A单核苷酸多态性存在强烈的连锁不平衡(|D'|=0.951)。联合基因型分析发现，3种单倍型分布频率在NPC组与对照组间分布差异有统计学意义(χ2=9.530，P=0.009)，-137C/-607A单倍型携带者显著增加了NPC的发病风险(OR=1.699，95%CI:1.174～2.457)，见表2。

四、NPC多因素Logistic回归分析

将全体研究对象作为整体进行分析，以性别、年龄、吸烟、饮酒、IL-18基因-137 G/C和-607 C/A多态性作为自变量，建立NPC的Logistic回归模型，见表3。经混杂因素调整后可见，IL-18基因-137 G/C多态性是NPC的独立危险因素。其他相关的危险因素有吸烟、饮酒，与公认的NPC危险因素相符。

图1 IL-18基因-137 G/C多态性8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳图

图2 IL-18基因-607 C/A多态性8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳图

图3 IL-18基因-137 G/C测序图

图4 IL-18基因-607C/A测序图

表1 NPC组与对照组IL-18基因多态性分布频率的比较

表2 NPC组与对照组IL-18基因单倍型分布频率的比较

3 讨 论

NPC是由环境因素和遗传基因相互作用而导致的一种头颈部恶性肿瘤。然其病因和发病机制尚未完全阐明，但细胞因子在其中的作用越来越受到重视。IL-18是一种具有多种生物学功能的细胞因子，IL-18除能强烈地诱导免疫细胞释放γ-干扰素(IFN-γ)、α-干扰素(TNF-α)等细胞因子外，其亦具有增强FasL表达和自然杀伤细胞(NK)细胞毒作用等多种生物学效能。IL-18在免疫调节、抗肿瘤及抗感染等方面有着潜在的应用前景，并与多种肿瘤的发病可能密切相关。近年来，许多临床研究表明IL-18基因转染到树突状细胞和乳腺癌细胞中均具有特异性和非特异性的抗肿瘤作用，认为IL-18在肿瘤的发病和活动性中可能起着重要的作用［6-7］。IL-18基因位于11号染色体长臂上，由6个外显子和5个内含子组成。研究表明，IL-18基因具有遗传多态性，这种基因多态性影响IL-18的基因转录和表达，进而影响到IL-18的生物学功能，从而影响到肿瘤的发生、发展。因而，我们推测IL-18基因多态性可能与肿瘤的易患性有关。

关于IL-18基因多态性与肿瘤的关系，文献报道较少。Farjadfar等［8］检测肺癌IL-18基因多态性，结果发现IL-18基因-607 C/A多态性与肺癌的发病具有相关性，其中-607 A等位基因频率在肺癌患者中显著高于对照组，-607 A等位基因携带者明显降低血清IL-18的表达，因而提出-607 A等位基因携带者机体抗肿瘤减弱，从而导致肺癌易感。Nong等［9］通过对NPC IL-18基因多态性的研究发现，IL-18基因-137 G/C多态性与NPC的发病具有相关性，其中-137 C等位基因可能是NPC的遗传易感基因;联合基因型进一步发现，-137 C/-607 A单倍型携带者明显增加了NPC的发病风险。但西班牙学者 Sáenz-López等［10］研究发现IL-18基因-137 G/C和-607 C/A两位点多态性与肾细胞癌都具有相关性。由于基因多态性存在地域间的差异，IL-18基因多态性与NPC之间是否真正存在相关性，目前尚无定论。为进一步明确IL-18基因多态性是否与NPC的发生相关，我们采用病例-对照的研究方法对IL-18基因多态性进行分析，结果发现NPC患者IL-18基因-137 G/C多态性分布与正常人比较差异具有统计学意义，其中C等位基因携带者频率在NPC组明显高于对照组(P＜0.05)。本研究为排除年龄、生活习惯等混杂因素对统计结果的干扰，采用Logistic回归分析后发现，IL-18基因-137 G/C多态性与NPC明显相关，是NPC的一个独立危险因素。联合基因型进一步分析发现，IL-18基因-137 G/C与-607 C/A单核苷酸多态性存在强烈的连锁不平衡(|D'|=0.951)，3种单倍型分布频率在NPC组与对照组间分布差异有统计学意义(χ2=9.530，P=0.009)，-137 C/-607 A 单倍型携带者明显增加了 NPC的发病风险(OR=1.699，95%CI:1.174～2.457)。结果提示，IL-18基因-137 G/C多态性和-137 C/-607 A单倍型与NPC的发病可能具有相关性，其中-137 C等位基因可能是NPC的遗传易感基因。本研究结果与Nong等［3］报道相一致。

综上所述，NPC是一种多因素参与的常见病，除环境因素影响之外，遗传因素在其中也起着更为重要的作用，通过本研究可以发现，IL-18基因-137 G/C多态性和-137 C/-607 A单倍型与NPC的发病可能具有相关性，其中-137 C等位基因可能是NPC的遗传易感基因。但IL-18基因多态性是通过何种机制对NPC产生影响以及在NPC发病中的确切分子机制尚待进一步研究。

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