ROC曲线评价G6PD活性对地中海贫血的初筛价值探讨

袁明生，易旺云，叶国娟

(1.中山市陈星海医院检验科，广东中山528415;2.中山市陈星海医院妇产科，广东中山528415)

地中海贫血是由于珠蛋白基因缺失或突变，导致珠蛋白链合成障碍的遗传性疾病。G6PD是体内参与葡萄糖无氧代谢的一种氧化还原酶，主要存在于红细胞的膜上，对于红细胞膜的稳定性具有重要作用。一旦缺乏，则可能导致红细胞被破坏而溶血的遗传病。2种疾病都属于出生缺陷的病种，目前均无有效治疗方法。广东地区既是G6PD缺乏症的高发地之一，又是地中海贫血高发地区之一，所以在人群中特别是孕妇中进行快速筛查，对这2种疾病的预防和发生具有极为重要的意义。地中海贫血筛查和G6PD活性检测均为广东地区产前检测项目。我们在日常产检中发现许多地中海贫血患者的G6PD活性增高，显示G6PD活性增高与地中海贫血之间存在一定的相关性，与陈冬等［1］的报道相似。为了解G6PD活性升高与地中海贫血的关系，探讨G6PD活性检测对地中海贫血辅助诊断的临床价值，我们对G6PD活性在地中海贫血筛查中的价值进行了综合评价。

材料和方法

一、一般资料

选取中山市陈星海医院2011年1月至2011年12月产检门诊和产科住院进行地中海贫血基因检测的孕妇229例，年龄20～45岁。根据基因检测结果，基因型为αα/αα和β基因未见17种异常的列为对照组，共66例。α或β-地中海贫血基因异常者列为地中海贫血组，共163例;其中α-地中海贫血(简称 α-地贫)组 94例、β-地中海贫血(简称β-地贫)组53例、两者均有(简称α+β-地贫组)16例。所有病例均排除G6PD缺乏、缺铁和其他原因引起的溶血性贫血。

二、仪器和试剂

G6PD活性定量检测试剂(液体双试剂)由广州科方生物技术有限公司提供，测定方法为速率法。检测仪器为日立7170A生化分析仪。每日用空白校准，340 nm波长吸光度＜0.2 ABS，每天质控均在控。地中海贫血基因检测送广东省中山市人民医院检验中心进行聚合酶链反应(PCR)分子遗传学诊断。

三、方法及参考范围

所有对象均抽取空腹静脉血4 mL，各取2 mL于肝素抗凝剂真空管和无抗凝剂真空管内送检。无抗凝剂真空管送中山市人民医院检验中心检测地中海贫血基因。肝素抗凝剂真空管检测G6PD活性，将肝素抗凝全血样本以3 000×g离心5 min后吸取20 μL压积红细胞到1 mL裂解液中，红细胞溶解后测定G6PD活性，须在25 min内测定完毕。按G6PD试剂说明书进行参数设定。选用广州科方生物技术有限公司自产的室内质控品，同时每天2次测定室内质控(G6PD活性为12.0 U/gHb)，在所有室内质控变异系数(CV)值＜5%的条件下检测G6PD活性。G6PD活性(U/gHb)=G6PD×64/H，式中H为血清信息Hemolytic指数法(是一种直接测定Hb的分光光度法)。成年女性参考区间为6.0～14.0 U/gHb，＞14.0 U/gHb为G6PD升高。

四、统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行数据统计处理。组间均数比较采用t检验;将①α-地贫组、②β-地贫组、③α+β-地贫组、④对照组全部资料录入SPSS13.0的数据文件(G6PD.sav)，采用两独立样本非参数检验方法进行统计分析。以G6PD为检验变量，诊断结果(“1”为异常、“0”为正常)为状态变量，作ROC曲线分析，计算曲线下面积(AUC);两诊断性试验诊断同一疾病用一致性和Kappa值判断。G6PD与 Hb数据分布通过SPSS13.0的分析→非参数检验→单个样本K-S检验，Hb呈非正态分布，G6PD呈近似正态分布，相关性采用Spearman分析。

结 果

一、地中海贫血各组与对照组G6PD活性的比较

地中海贫血组G6PD活性明显高于对照组(P=0.000);α-地贫组、β-地贫组及 α +β-地贫组G6PD活性均高于对照组(P=0.000)，见表1。

二、ROC曲线绘制和Cut-off值的确定

1.ROC曲线绘制 G6PD活性诊断地中海贫血的AUC为0.757，95%CI为0.690～0.823，不包括0.5，见图1。

图1 G6PD活性诊断地中海贫血的ROC曲线

2.Cut-off值的确定 根据ROC曲线中各可能诊断界点的敏感性和特异性，计算Youden指数。以Youden指数最大的诊断界点为最佳临界点。G6PD活性诊断地中海贫血的最佳临界值为11.95 U/gHb，其敏感性为 0.693、特异性为0.773、阳性预测值(PPV)为0.88、阴性预测值(NPV)为0.50、阳性似然比(+LR)为3.05、阴性似然比(-LR)为 2.52、Youden指数最大为0.466。

三、G6PD活性与PCR诊断地中海贫血的结果比较

以G6PD活性=11.95 U/gHb为Cut-off值，G6PD活性诊断地中海贫血的结果与PCR基因诊断结果比较见表2。两者的一致性为71.6%、Kappa值为0.402。

表2 G6PD活性与PCR基因检测结果比较 (例)

四、G6PD与贫血严重程度的相关性分析

对229例孕妇的Hb和G6PD数据分布进行正态分布检验，G6PD呈近似正态分布，Hb呈非正态分布，采用Spearman相关性分析，相关系数(r)=-0.120，P=0.129。G6PD与贫血程度呈负相关，但相关性并不密切(r＜0.5)。

五、地中海贫血基因突变类型及其构成比

在163例地中海贫血样本中检出的基因突变类型见表3。

表3 地中海贫血基因突变类型及构成比

讨 论

地中海贫血是由于一种因珠蛋白基因缺失或突变导致珠蛋白肽链合成障碍，使Hb中的一种或一种以上的珠蛋白链缺如或不足所致的一种单基因遗传性溶血性疾病。本病广泛分布于世界许多地区，东南亚是高发区之一。中国以广东、广西、四川多见。地中海贫血大致上分为α-地贫和β-地贫2大类。地中海贫血的诊断分为初筛和确诊2种，筛查的方法有MCV和Hb电泳等，确诊采用基因诊断的方法。

本研究结果显示地中海贫血各组G6PD活性均高于对照组(P=0.000)。地中海贫血组95%CI下限为12.66 U/gHb、上限为 13.66 U/gHb，而对照组95%CI下限为10.09 U/gHb、上限为11.16 U/gHb。二者95%CI不重叠，故G6PD活性增高(＞11.16 U/gHb)可用于地中海贫血的筛查或辅助诊断，与国内的研究结论［1-5］相同。究其原因:(1)陈冬等［1］认为很可能是由于地中海贫血患者体内慢性溶血所致贫血，贫血刺激机体代偿产生较多年轻红细胞，而G6PD为胞龄依赖酶［6］，在年轻红细胞中活性较高，故G6PD活性增高;(2)G6PD是红细胞葡萄糖磷酸戊糖旁路代谢中所必需的脱氢酶，此酶缺乏会导致NADPH生成障碍，使Hb易氧化而发生溶血;(3)地中海贫血由于基因突变或缺失，导致珠蛋白肽链生成失去平衡，使多余的肽链沉积在红细胞膜上引起过氧化损伤［7］;为抵抗过氧化损伤，修复损伤的膜蛋白和脂蛋白，G6PD代偿性增高［8］;(4)地中海贫血患者的红细胞普遍较小，呈小细胞低色素性贫血，且红细胞大小不等，中央线染检查区扩大，出现异形、靶形及碎片红细胞，导致单位体积内红细胞数目以及红细胞膜表面积增高，而G6PD存在于红细胞的膜上，从而导致G6PD活性的增高［9］。

本研究显示G6PD与贫血程度呈负相关(r=-0.120，P=0.129)，但相关性并不密切。原因可能为G6PD不是Hb合成过程中需要的酶，并不影响Hb合成的量和速度，只影响红细胞膜的稳定性。而地中海贫血是由于体内慢性溶血所致。

根据循证检验医学和利用ROC曲线分析，本研究显示G6PD活性诊断地中海贫血ROC曲线下面积为0.757，根据Swets的判断标准，面积在0.7～0.9之间有一定的准确性，以11.95 U/gHb为Cut-off值。该点的敏感性为0.693、特异性为0.773、PPV 为0.88、NPV 为0.50、+LR 为3.05、-LR为2.52。此时与PCR诊断地中海贫血比较，其一致性为71.6%，Kappa值为 0.402(在0.40～0.75范围内)，也支持G6PD活性可用于地中海贫血的诊断。

本研究资料表明G6PD活性虽然可用于地中海贫血的诊断，但AUC只有0.757，+LR和-LR仅为3.05和2.52，Kappa值仅为0.402，诊断指数为146.6%，接近150%［10］，对地中海贫血有一定的辅助诊断作用，可以增加验后患地中海贫血的概率。在没有地中海贫血PCR基因检测的条件下，红细胞G6PD活性的增高可以作为临床实验室综合分析诊断地贫较简便的方法，在MCV＜80 fL、Hb电泳HbA2正常而又排除缺铁性贫血的情况下，如果G6PD活性增高，应考虑α-地贫复合β-地贫［1］。

综上所述，所有G6PD活性升高者，应高度怀疑地中海贫血，应进一步做地中海贫血基因检测进行确诊，以减少漏诊。

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