Girdin对恶性胶质瘤细胞增殖和运动能力的影响

李智慧 王 静 谷 峰 马勇杰

恶性脑胶质瘤具有弥漫性、高侵袭性、预后差的特点，是一类最常见的恶性程度极高的中枢神经系统肿瘤，约占颅内原发肿瘤的40%，占中枢神经系统恶性肿瘤的78%［1］，传统的放化疗以及手术治疗效果较差。在恶性胶质瘤中，患者死亡的首要原因是瘤细胞的恶性增殖和浸润［2-3］。然而有关该肿瘤的增殖、凋亡以及肿瘤从原发部位浸润到周围正常组织的分子机制待进一步研究。

研究发现细胞内肌动蛋白骨架结构的重组是细胞形态改变和细胞运动的关键［4］，Girdin是新发现的肌动蛋白结合蛋白，在多种肿瘤细胞中呈现高表达。Jiang等［5］研究通过检测180份恶性肿瘤的组织样本，包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、子宫颈癌、甲状腺癌等，发现Girdin在以上恶性肿瘤组织中均有不同程度的高表达，高表达率占10%～50%，提示Girdin与肿瘤的发展密切相关。通过对Girdin的结合蛋白，如Akt、肌动蛋白、异源三聚体G蛋白及肌动蛋白GTP酶等的研究，人们逐步发现其能够通过调节细胞G蛋白偶联受体信号或膜转运信号，进而影响细胞运动等过程［6-7］。

本文以胶质瘤作为研究对象，以期发现Girdin在胶质瘤发生中的作用。采用小RNA干扰技术抑制恶性胶质瘤细胞LN229中Girdin蛋白的表达，研究Girdin蛋白对胶质瘤细胞生长、运动的影响，并探讨其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人胶质瘤细胞株LN229购自美国ATCC（American Type Culture Collection）。脂质体转染试剂盒Lipofectamin 2000购自Invitrogen公司，兔抗人多克隆抗体Girdin购自美国Santa Cruz公司。PAGE凝胶电泳仪：美国Bio-Rad公司。垂直电泳槽：美国Bio-Rad公司。趋化小室和聚碳酸酯膜购自Neuro probe公司。Matrigel购自美国BD Biosciences。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 按照ATCC所推荐的标准进行培养。LN229细胞用含l0%胎牛血清的RPMI 1640培养液（含青霉素、链霉素各100 U/mL），在含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染 培养LN229细胞使其充分贴壁覆盖率达到60%～70%。Girdin siRNA特异性干扰质粒siGirdin（5'-GAAGGAGAGGCAACTGGAT-3'［7］）由GenePharma公司构建合成，用Lipofectamin 2000进行质粒转染，Western blotting检测Girdin的表达。

1.2.3 Western blotting 细胞裂解提取蛋白后，用SDS-PAGE胶电泳分离，转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，一抗Girdin（1：50），碱性磷酸酶偶联的二抗室温孵育1 h。

1.2.4 细胞增殖实验 将相同细胞数（3.5×104cells）的实验组细胞（siGirdin/LN229）与对照组细胞（scr/LN229）分别种入12孔盘中，37°C，5%CO2培养箱中正常培养，记为第0天，从第2天开始，每24 h分别将两组细胞的一个孔中细胞消化收集，细胞计数，连续计数6 d，实验重复3次，把所得数据求均数与标准差，最终绘成曲线。

1.2.5 划痕实验［8］取处于对数生长期的8×105个实验组细胞（siGirdin/LN229）与对照组细胞（scr/LN229）分别种入35 mm培养皿培养过夜。用10 μL枪头在培养皿的中央划一条直线，连续观察0，3，6，9，24 h，拍照并测量实验组和对照组细胞向中线移动的距离（规定时间点测量最前沿细胞之间的距离并计数，最后以0 h的距离作为基点求出差值），独立重复3次实验后进行统计。

1.2.6 侵袭实验［5］取出已稀释好的Matrigel，冰浴融化，以50 μL的体积铺于Transwell小室（24孔板小室）聚碳酸酯膜上37°C放置lh，使Matrigel聚合成凝胶，在Transwell下室中加入趋化因子EGF（10 ng/mL）600 μL/孔。在上室孔中准确加入细胞l×105个/孔，细胞悬液体积200 μL，置于5%CO2培养箱于37°C培养24 h。随后姬姆萨染色，冲洗干净后，倒置显微镜下直接观察穿过膜的细胞（200×），每张膜中央部分和周围部分各随机取3个视野，计数每个视野内的穿过8 μm微孔的细胞数。独立重复3次实验后进行统计。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 小RNA干扰对恶性胶质瘤细胞LN229中Girdin表达的影响

选取胶质瘤细胞株LN229，实验组转染小RNA干扰质粒siGirdin，阴性对照组转染带有无关序列的对照质粒（scr），用G418筛选出稳定克隆，通过Western blotting检测Girdin的表达水平，结果显示通过小RNA干扰技术转染Girdin质粒，能够有效的沉默恶性胶质瘤LN229细胞中Girdin蛋白的表达，与阴性对照组和亲本LN229相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），而阴性对照组和亲本LN229比较差异无统计学意义（图1）。

图1 Western blotting法检测转染小RNA干扰质粒后LN229细胞中Girdin的表达（scr/LN229为转染无关序列质粒的亲本对照，siGirdin/LN229即为转染siGirdin后LN229细胞中筛选出来Girdin表达水平降低的细胞）Figure1 Western blot analysis indicated that the expression of Girdin in LN229 cells decreased after they were transfected with siGirdin plasmid（scr/LN229 is the parent control transfected with unrelated sequence plasmid，whereas siGirdin/LN229 is the LN229 cell transfected with siGirdin）

2.2 Girdin蛋白降表达后对肿瘤细胞生存的影响

采用细胞增殖实验连续观察6 d中两组细胞增殖能力的差异，结果显示从第3 d开始siGirdin/LN229组细胞的增殖率明显低于scr/LN229组（图2），差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图2 Girdin的表达水平降低后对LN229细胞增殖能力的影响Figure2 Reduction of Girdin expression affected the proliferation ability of LN229 cells

2.3 Girdin蛋白降表达后对肿瘤细胞迁移能力的影响

在没有化学诱导因子浓度梯度的情况下，细胞可以感受到“伤口”，并通过重组微管组织中心（MTOC）沿垂直于伤口划痕的方向运动［9］。将划痕后的实验组细胞和对照组细胞用RPMI-1640+10%FBS的培养液培养24 h，在不同时间点对细胞向伤口方向的运动进行记录。与对照组细胞相比，siGirdin/LN229细胞迁移能力明显降低（P＜0.05，图3），表明Girdin降表达后明显的抑制了LN229细胞的迁移能力。

图3 Girdin表达水平降低后对LN229细胞二维运动能力的影响Figure3 Reduction of Girdin expression affected the movement ability of LN229 cells

2.4 Girdin过表达对恶性胶质瘤细胞增殖的影响

通过慢病毒法提高LN229细胞内Girdin表达水平，Western blotting检测结果显示Girdin表达水平升高，采用细胞增殖实验连续观察6 d中两组细胞增殖能力的差异，显示细胞增殖能力无明显变化（图4）。

图4 Western blotting法检测Girdin在LN229细胞中的表达水平提高，Girdin表达升高后对LN229细胞增殖能力的影响Figure4 Western blot analysis indicated that the Girdin expression level in LN229 cells increased,which affected the proliferation ability of LN229 cells

2.5 Girdin降表达影响恶性胶质瘤细胞的侵袭能力

胶质瘤细胞侵袭性生长的关键事件是基质金属蛋白酶通过与细胞粘附分子相互作用降解细胞外基质，促进肿瘤细胞向周围脑组织生长［10］。在相同细胞条件和培养时间下聚碳酸酯膜滤孔内侵袭的细胞数量可以在一定程度上反映细胞的侵袭能力。经过统计发现对照组scr/LN229细胞和siGirdin/LN229细胞穿过聚碳酸酯膜滤孔的平均视野细胞数为33和15个，差异具有统计学意义（P＜0.05，图5）。

图5 Girdin表达水平降低后对LN229细胞的侵袭能力的影响Figure5 Reduction of Girdin expression affected the invasive ability of LN229 cells

3 讨论

Girdin通过调节肌动蛋白的结构来促进肿瘤细胞的侵袭、迁移等过程［11］。为进一步了解Girdin与肿瘤细胞运动和增殖的关系，本研究探讨了Girdin蛋白表达水平的不同在恶性胶质瘤细胞运动能力中所发挥的作用。

本研究通过小RNA干扰技术降低Girdin在胶质瘤细胞中的表达并筛选出Girdin降表达细胞株siGirdin/LN229，细胞增殖实验表明siGirdin/LN229细胞的增殖能力较对照组细胞scr/LN229明显下降，这种趋势在第3天开始具有统计学意义，表明Girdin降表达后LN229细胞增殖能力明显下降。通过慢病毒技术感染LN229细胞提高Girdin表达水平后，增殖实验表明Girdin高表达对细胞增殖能力无明显影响。

划痕实验表明Girdin降表达后明显的抑制了LN229细胞的迁移能力24 h时scr/LN229细胞划痕几乎完全愈合而siGirdin/LN229划痕距离较大；侵袭实验显示Girdin降表达的细胞与对照组相比迁移能力明显下降，经过统计发现对照组细胞和siGirdin/LN229细胞平均视野侵袭细胞为33和15个，Girdin降表达的细胞与对照组相比迁移能力明显下降。划痕实验和侵袭实验结果具有一致性，显示Girdin降表达明显影响恶性胶质瘤LN229细胞在二维及三维空间的运动能力。

Jiang等［5］发现Girdin蛋白的高表达能够促进乳腺癌的侵袭及转移能力，该研究组将野生型的Girdin转染到Girdin表达降低的乳腺癌细胞（MDA-MB-231）后，发现细胞的侵袭能力得到恢复。与之相比，转染了突变型（丝氨酸突变为丙氨酸）的Girdin细胞运动功能仍然受限。说明Girdin降表达以后乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力下降。本研究采用RNA干扰技术使Girdin在LN229细胞中表达降低，通过划痕、侵袭等实验充分证明Girdin蛋白与胶质瘤细胞的侵袭及转移能力相关。

转移是恶性肿瘤患者的主要死亡原因。众所周知，细胞的迁移不仅是细胞进行生理活动的重要基础，在很多癌症的演进过程中起到重要的作用，同时也是肿瘤发生、发展等病理过程中的重要步骤和关键环节［12］。研究发现细胞迁移与细胞形态变化有着密切的关系［13-14］，细胞内肌动蛋白骨架结构的重组是细胞形态改变和细胞运动得以实现的关键。肌动蛋白是细胞骨架中微丝的主要成份，而近年来的研究进一步证实，细胞骨架系统与癌变等生命现象密切相关，肌动蛋白骨架结构的完整及其自身结构的动态重组在维持细胞形态，实现细胞迁移的过程中发挥关键作用［15］。

本文研究结果表明Girdin降表达对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭具有抑制作用，提示Girdin可作为胶质瘤治疗的新的靶点，以控制胶质瘤细胞侵袭和转移。

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