β－tubulin在输卵管妊娠着床部位与非着床部位的表达

程秀娟 熊国平 汪 琳

（1河南中医学院人体解剖与组织胚胎学教研室，郑州450008；2武汉市中心医院妇产科，武汉430014；3武汉大学基础医学院组织胚胎学教研室，武汉430071）

输卵管是重要的生殖器官，是配子运送、受精以及早胚发育的场所［1］。精卵结合形成受精卵、卵裂的发生、早胚的发育等一系列程序化的发育过程都在输卵管中进行，与输卵管微环境相互作用，并按其特定的程序逐渐发生。哺乳动物包括人的生殖周期中，伴随血清雌孕激素水平的周期性波动，输卵管粘膜的结构和功能也发生周期性的变化［2］。输卵管的组织结构和功能发生异常改变，将影响受精卵的发育和运送，导致异位妊娠的发生。输卵管妊娠是最常见的异位妊娠。输卵管妊娠严重危害妇女的生命和健康，因此研究其发生机制有着重要意义.现已知，正常输卵管β－tubulin的表达分泌期强于增生期，妊娠输卵管中β－tubulin的表达比分泌期减弱，β－tubulin在妊娠输卵管组织中的低表达可能是输卵管妊娠的影响因素［3］，但β－tubulin在输卵管妊娠着床部位与非着床部位的表达如何，目前未见报导。本实验检测β－tubulin在输卵管妊娠着床部位与非着床部位的表达，为进一步明了输卵管妊娠的发生机制提供重要的实验资料。

材料和方法

1.材料

收集武汉市中心医院2004年2月－2005年2月临床和病理确诊为输卵管妊娠的部分输卵管组织20例及因子宫良性肿瘤手术切除的部分正常输卵管组织20例。两组均要求患者平时月经周期规律，输卵管妊娠患者要求无盆腔炎和盆腔手术操作史及未使用宫内节育器史。

2.主要试剂

鼠抗人微管蛋白β单克隆抗体浓缩液，链霉素抗生物蛋白－过氧化物酶连结（SP）试剂盒及DAB显色试剂盒购于北京中山生物技术公司。

3.方法

3.1 标本处理 将手术切除的正常输卵管及异位妊娠输卵管组织立即置于4%中性甲醛固定24h，取材（妊娠输卵管分别取着床部位与非着床部位），常规酒精逐级脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片。切片厚度为4μm，贴附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，待作常规HE染色及免疫组化染色。

3.2 HE染色及光学显微镜观察 各例标本作常规HE染色，在光镜下观察正常输卵管、妊娠输卵管组织的形态结构变化，根据临床资料及光镜特点将正常输卵管组织分为增生期组和分泌期组。选取正常输卵管分泌期，输卵管妊娠着床部位与非着床部位三组做免疫组化染色。

3.3 检测方法 采用链菌素抗生物素蛋白－过氧化物酶免疫组化法（S－P法）分别检测正常输卵管分泌期、输卵管妊娠着床部位与非着床部位β－tubulin的表达。用PBS液代替一抗作阴性对照。实验步骤按SP试剂盒说明书进行。

3.4 判断标准 在光学显微镜下观察细胞着色情况，以细胞内出现棕黄色颗粒为阳性，空白对照为阴性。

4.定量分析

采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统检测，测定各组免疫组化反应阳性颗粒的平均光密度。

5.统计学处理

对各项免疫组化反应阳性颗粒的平均光密度作t检验，检验水准为0.05。

结 果

β－tubulin阳性表达为棕黄色，定位于细胞质。输卵管上皮细胞、平滑肌细胞、纤维细胞和炎细胞等为阳性表达，输卵管上皮细胞中的纤毛细胞纤毛部着色尤为明显。红细胞为阴性表达。

正常输卵管分泌期组织、输卵管上皮细胞、平滑肌细胞和纤维细胞等染色呈深棕黄色（图1），输卵管妊娠非着床部位输卵管上皮细胞、平滑肌细胞和纤维细胞等染色较正常输卵管分泌期组织减弱（图2），输卵管妊娠着床部位输卵管上皮细胞、平滑肌细胞和纤维细胞等染色浅淡，较输卵管妊娠非着床部位进一步减弱（图3↑，↑所指区域以外为输卵管妊娠破裂释放物）。阴性对照组所有组织及细胞均未见着色。图像分析结果显示：输卵管妊娠非着床部位粘膜上皮中的β－tubulin的表达比正常输卵管分泌期减弱；输卵管妊娠着床部位β－tubulin的表达比非着床部位减弱（表1）。差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1 输卵管妊娠着床与非着床部位β－tubulin表达的平均光密度值（±s）Table 1 The average optical density ofβ－Tubulin in implantation or non implantation site of pregnant oviduct（±s）

表1 输卵管妊娠着床与非着床部位β－tubulin表达的平均光密度值（±s）Table 1 The average optical density ofβ－Tubulin in implantation or non implantation site of pregnant oviduct（±s）

＊和△与对照组比较（compared with control group）P＜0.05

Group β－Tubulin Secretory phase oviduct（control）0.17718±0.00092 Non implantation site of pregnant oviduct 0.17401±0.00125＊Implantation site of pregnant oviduct 0.17287±0.00110△

图1 β－tubulin在正常输卵管分泌期粘膜上皮（↑示上皮）中的强表达。SP×200图2 β－tubulin在输卵管妊娠非着床部位粘膜上皮（↑示上皮）中的表达弱于正常输卵管分泌期。SP×200图3 β－tubulin在输卵管妊娠着床部位的粘膜上皮（↑示上皮）中的表达弱于非着床部位。SP×200Fig.1 The strong expression ofβ－tubulin in the mucosal epithelium of normal oviduct of secretory phase.SP×200Fig.2 The positive expression ofβ－tubulin in the non implantation site of pregnant oviduct was lower than that in the secretory phase of normal tubal tissue.SP×200Fig.3 The positive expression ofβ－tubulin in the implantation site was lower than that in the non implantation site of pregnant oviduct.SP×200

讨 论

细胞骨架系统不仅维持细胞形态和结构完整，而且通过与其他细胞之间特异或非特异性地相互作用，在传递压力和张力及感知微环境物理作用方面起重要作用［4］，是细胞内重要的信号转导装置［5］。微管系统是细胞骨架的重要组成部分，微管是由α－微管蛋白（α－tubulin）和β－微管蛋白（β－tubulin）两个亚基组成的微管蛋白异二聚体纵向排列而成的中空管状结构，大多数微管都表现出动力学的不稳定性，以动态的聚合、解聚及两者之间随机转换的形式存在［6］。微管多存在于细胞质中，是纤毛、鞭毛等运动性结构的组成部分，主要参与细胞运动、细胞器的定位、胞内物质的运输及真核细胞的有丝分裂过程，对细胞有支持和运动作用。实验采用免疫组化的方法检测β－tubulin在正常输卵管分泌期、输卵管妊娠着床部位与非着床部位的表达。结果显示：正常输卵管分泌期β－tubulin的表达强于输卵管妊娠非着床部位；输卵管妊娠着床部位β－tubulin的表达比非着床部位明显减弱。输卵管上皮由分泌细胞和纤毛细胞构成，分泌细胞的分泌物构成输卵管液，可营养卵，辅助卵的运行，纤毛细胞的纤毛向子宫方向摆动，以及平滑肌的蠕动可将卵推向子宫，这对配子和早胚在输卵管中的运送起着重要的作用。我们推测，可能由于某种原因导致β－tubulin在输卵管分泌期的表达异常降低，使分泌细胞的分泌以及纤毛细胞、平滑肌细胞的活动受到抑制，分泌减少使输卵管液的量及成分发生改变而影响早胚的营养发育和运送，纤毛的摆动减弱以及平滑肌的蠕动减弱，对早胚的运送减慢，使胚泡滞留于输卵管。细胞骨架接受胞外信号，对化学信号和物理信号产生应答。细胞骨架可探测细胞外基质的力学特性，胞外物理介质反过来又会影响细胞骨架的组装［7］。微管受到外力时，随着外力的增加，完全解聚的可能性增大［8］。胚泡滞留于输卵管后错误粘附于输卵管上皮，并对输卵管着床部位产生一定的压力。着床部位的输卵管组织细胞在接受了胚泡粘附和压力的信号后，通过调控机制使该区域组织细胞微管解聚，β－tubulin表达减低，细胞的刚性降低，细胞易于变形，使胚泡更易于在组织中移动，使胚泡在着床部位向深处浸润。导致异位着床的因素很多，β－tubulin表达的降低可能是其中的影响因素之一。

［1］Magdalena Nutu，Birgitta Weijdegård，Peter Thomas，et al.Distribution and hormonal regulation of membrane progesterone receptorsβandγin ciliated epithelial cells of mouse and human fallopian tubes.Reproductive Biology and Endocrinology，2009，7：89 doi：10.1186／1477－7827－7－89

［2］杨刚 主编.内分泌生理与病理生理学.1994年，第三版，天津科学技术出版社，525

［3］熊国平，程秀娟，汪琳等.β－tubulin在正常及妊娠输卵管组织中的表达.中国组织化学与细胞化学杂志，2007，16（6）：706－709

［4］Janmey PA，McCuiioch CA.Cell mechanics：integrating cell responses to mechanical stimuli.Annu Rev Biomed Eng，2007，9（1）：1－34

［5］Han X，Li Z，Chen H，et al.Influenza Virus A／Beijing／501／2009（H1N1）NS1 Interacts with b－Tubulin and Induces Disruption of the Microtubule Network and Apoptosis on A549 Cells，PLoS ONE 2012，7（11）：e48340

［6］Toshiyuki O，Nobutake H，Masahide K.Three－dimensional structures of the flagellar dynein－microtubule complex by cryoelectron microscopy.J Cell Biol，2007，177（2）：243－252

［7］Discher DE，Janmey P，Wang YL.Tissue cells feel and respond the stiffness of their substrate.Science，2005，310（5751）：1139－1143

［8］Wang N，Tytell JD，Ingher DE.Mechanotransduction at a distance：mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus.Nature Rev Mol Cell Biol，2009，10（1）：75－82