姜黄素对Aβ诱导的AD大鼠海马CRMP－2表达的影响

尹红蕾 李金凤 乔立艳 曾志磊 王运良△ 刘亚君

1）解放军第148中心医院神经内科 淄博 255300 2）郑州大学第二附属医院神经内科 郑州 450014

轴突抑制因子［1］在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的发生、发展中起着重要作用，塌陷反应介导蛋白－2（collapse response mediator protein 2，CRMP－2）能够促进轴突生长［2］，磷酸化的 CRMP－2还参与了阿尔茨海默病中［3－4］神经突退行性变及神经纤维缠结的形成。我们构建Aβ诱导的认知障碍大鼠模型，观察姜黄素对AD大鼠空间学习记忆能力及海马内CRMP－2和磷酸化CRMP－2的影响，并对比轴突蛋白的生长变化，探讨姜黄素治疗阿尔茨海默病的机制。

1 材料和方法

1.1 试剂 主要试剂及仪器：Aβ1－40（美国Sigma公司），姜黄素（美国Sigma公司），小鼠抗Neurofilament 200抗体（武汉博士德生物工程有限公司），兔抗CRMP－2抗体和兔抗p－CRMP－2抗体（美国CST公司）。Morris水迷宫，脑立体定位仪（日本成茂公司），凝胶扫描成像仪（BIO－RAD公司），BS－50型光学显微镜（Olympus，German），图像分析系统（北航CM－2000B型），RT－PCR反应试剂盒（TakaRa，大连宝生物公司）。

1.2 动物及分组 重庆医科大学实验动物中心提供健康雄性SD大鼠共53只，体质量230～250g。大鼠适应性喂养1周后，先进行Morris水迷宫测试，在4个象限测试中有2个象限超过2min未找到安全平台者视为记忆障碍。淘汰后剩余的48只大鼠随机分为3组：（1）空白对照组：海马注射等容量的生理盐水，腹腔注射与姜黄素等量的DMSO（n＝16）；（2）AD对照组：腹腔注射与姜黄素等量的DMSO（n＝16）；（3）姜黄素给药组：腹腔注射溶解在DMSO的姜黄素（n＝16），1次／d，剂量300mg／kg，连续注射7d［5］。

1.3 制备β淀粉样蛋白诱导的大鼠认知障碍模型 Aβ1－40用无菌生理盐水稀释成10μg／μL，37℃下孵育1周后变为聚集态Aβ。3.5%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后固定于立体定位仪上，按 “大鼠脑立体定位图谱”［6］，选择右侧海马CA1区为注射靶区，于前囟向后3.0mm，中线旁开2.2mm钻开颅骨，微量进样器自脑表面垂直进针2.8mm，将10μL Aβ1－40缓慢注入，留针10min以保证溶液充分弥散，然后缓慢撤针。空白对照组注入等体积生理盐水。各组术后均单笼饲养至大鼠完全清醒。

1.4 Morris水迷宫行为学测试 动物模型制备1个月后，用Morris水迷宫法测定大鼠的学习记忆能力［7］。首先进行定位航行试验 （place navigation）：历时5d，2次／d，将大鼠面向池壁分别从2个入水点放入水中，记录大鼠在2min内找到平台的时间 （即逃避潜伏期，escape latency）和游泳路径。如果在2min内大鼠未找到平台，潜伏期记为120s，实验者用木棒牵引大鼠至平台上并停留10s后放回笼中。通过对训练大鼠游泳寻找平台，观测其逃避潜伏期可检测动物的学习能力。第6天撤除平台，任选一个入水点将大鼠放入水中，进行空间探索试验 （spatial probe），记录2min内大鼠在池中的游泳轨迹和时间，分别计算在各象限停留时间的百分比。

1.5 标本取材 腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉后直接取脑（每组8只），置于冰面上的培养皿上，取右侧海马，分成两份，放入用DEPC水浸泡过夜且已消毒的冻存管中，置于液氮中冷冻，2～3h后转移－80℃冰箱中保存。剩余动物（每组各8只）心内灌注、固定、取材海马部位，石蜡包埋，作石蜡切片（片厚4μm），行免疫组织化学检查。

1.6 RT－PCR检测海马内 CRMP－2mRNA的表达 用Trizol一步法提取海马组织总RNA。逆转录反应参数30℃10 min，50℃30min，99℃5min，5℃5min，瞬间离心。聚合酶链反应：40μL体系，以逆转录所得cDNA 10μL为模板，上游引物0.5μL、下游引物0.5μL。扩增参数为（94℃，2min）×1循环；（94℃30s，55～64℃30s，72℃36s）×35循环；72℃5min。结果用Quantity One－4.6.2软件进行半定量分析，以目的基因的面积积分灰度值与β－actin基因区带的面积积分灰度值之比表示目的基因的表达水平。

1.7 Western blotting 方 法 检 测 海 马 内 CRMP－2 和 p－CRMP－2蛋白表达 按照提取试剂盒说明提取蛋白，上样进行变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）后移至PVDF膜上，将PVDF膜浸泡在含5%脱脂奶粉的封闭液中冲洗；将封闭后的PVDF膜在室温下与兔抗CRMP－2抗体（1∶300）和兔抗p－CRMP－2抗体（1∶300）孵育1h，漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG第二抗体（1∶5 000）室温下孵育1h。加新配制的显色液（Super ECL检测液）显色后晾干并照相保存。结果用Quantity One－4.6.2软件进行分析，以目的蛋白的面积积分灰度值与β－actin蛋白区带的面积积分灰度值之比表示目的蛋白的表达水平。

1.8 免疫组织化学方法检测海马内轴突蛋白表达 切片常规脱蜡至水，微波修复抗原，滴加小鼠抗Neurofilament 200抗体（1∶200），4℃孵育过夜；加二抗后，DAB显色，然后脱水、透明、封片；PBS代替一抗作阴性对照；光学显微镜下观察，棕黄色颗粒为免疫阳性细胞。

1.9 统计学分析 数据以均数±标准差（BZ_15_1694_320_1782_360）表示，采用SPSS 11.0统计软件行单因素方差分析，检验水准α＝0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠行为学检测 各组大鼠在Morris水迷宫定向航行试验中的平均逃避潜伏期日渐缩短，表明通过学习训练大鼠学习寻找平台的能力得到了提高。从第2天开始，AD对照组与空白对照组对比发现平均逃避潜伏期明显延长（P＜0.05，表1），大鼠轨迹图多以边缘式和随机式为主，表明造模成功。如表2所示，撤去第Ⅱ象限中的平台后，发现AD对照组在第Ⅱ象限的活动时间较其他2组明显缩短（P＜0.05，表2），显现出学习记忆力明显减退。而姜黄素给药组与空白对照组间对比发现大鼠学习、记忆能力无显著差异（P＞0.05），表明姜黄素能够显著改善认知功能障碍大鼠的学习和记忆能力。

图1 大鼠海马区CRMP－2和p－CRMP－2蛋白的表达1：空白对照组；2：AD对照组；3：姜黄素对照组

2.2 姜黄素对 AD 大鼠海马区 CRMP－2mRNA、CRMP－2蛋白和p－CRMP－2蛋白表达的影响 海马内注射Aβ1－40后CRMP－2mRNA 的表达较 空 白 组 明显降低 （P＜0.01），Western blotting结果显示CRMP－2蛋白的表达也显著降低，而姜黄素治疗组CRMP－2mRNA和蛋白表达均升高，与AD模型组对比差异有统计学意义（P＜0.05）。Western blotting结果显示海马内注射 Aβ1－40后 p－CRMP－2蛋白的表达较空白组明显升高（P＜0.05），而给予姜黄素治疗后则显著降低（P＜0.01），但仍高于空白对照组。见表3、图1。

2.3 姜黄素对各组大鼠海马区轴突蛋白表达的影响 空白对照组大鼠海马区神经元形态正常，几乎每个神经元都有轴突表达，而AD模型对照组大鼠海马区域的神经元轴突表达明显减少（P＜0.05），两者光密度值分别为0.2135±0.0278和0.1146±0.0169。姜黄素给药组与AD对照组比较显示，前者轴突表达有所增加，光密度值为0.1741±0.0178，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

表1 各组大鼠逃避潜伏期变化 （BZ_15_1694_320_1782_360，s）

表2 大鼠在各象限停留时间的百分比 （BZ_15_1694_320_1782_360，%）

表3 各组大鼠海马区CRMP－2mRNA、CRMP－2和p－CRMP－2蛋白情况 （BZ_15_1694_320_1782_360）

图2 大鼠海马轴突蛋白的表达（DAB×400）A：空白对照组；B：AD对照组；C：姜黄素治疗组

2.4 p－CRMP－2蛋白表达与轴突生长情况的相关性分析p－CRMP－2蛋白表达与轴突的生长情况呈直线负相关（r＝－0.67308，P＜0.05）。见图3。

图3 各组大鼠海马区p－CRMP－2蛋白表达与轴突生长情况的相关散点图

3 讨论

姜黄素（curcumin）是从植物姜黄中提取的一种酚性色素，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等一系列作用，分子式为C21H20O6，安全低毒［8］。据报道，临床及实验室应用姜黄素迄今为止尚未发现明显的不良反应，因而与非甾体抗炎药［9］及其他抗氧化药物相比，应用姜黄素已经成为治疗AD安全、有效的新措施之一［10］。本研究中，Morris水迷宫显示AD对照组较其他2组的空间学习记忆障碍更明显，姜黄素治疗组大鼠空间学习记忆能力虽低于空白对照组，但较AD对照组显著提高，提示姜黄素对AD大鼠空间学习记忆能力有明显改善作用，一定程度上可预防Aβ1－40导致的大鼠记忆和认知功能下降。已有研究证实姜黄素能够有效地抑制Aβ的生成和聚集［11］，从而减轻 AD患者临床症状［12］和病理改变［11］，但具体机制是否通过Rho－Rho激酶信号通路的下游信号分子CRMP－2，目前国内外尚无研究。

CRMP－2 在神经导向中发挥重要作用［2，13－14］，有研究发现［15］CRMP－2可通过促进微管合成来诱导轴突延伸，而CRMP－2磷酸化后则丧失了与微管蛋白异二聚体及微管蛋白结合并促进微管组装的能力［16］，从而失去了促进轴突生长的作用。本实验中，海马内注射Aβ1－40后出现轴突再生障碍，可能与诱导了CRMP－2的磷酸化，从而使微管蛋白的动力学状态发生改变，诱导生长锥塌陷，从而阻碍轴突再生有关。有研究者［17］在转基因痴呆小鼠皮质中观察到CRMP－2蛋白随着小鼠年龄的增长而降低，这与我们观察的结果相类似，我们发现磷酸化的CRMP－2蛋白表达与轴突蛋白表达呈负相关，也就是说p－CRMP－2蛋白不利于轴突蛋白的生长，这意味着Aβ1－40可导致脑内CRMP－2下降，并削弱CRMP－2对轴突生长的促进作用，我们也确实发现海马内注射 Aβ1－40后 CRMP－2呈现下降趋势，这与 Steven等［3］研究结果一致。

由于CRMP－2对神经元轴突的极化、延伸都起着非常重要的促进作用，它的降低可能会影响到痴呆后神经再生及神经修复的整个过程，导致认知功能障碍持续进展。此外，CRMP－2的磷酸化还能导致自身作用的失活，诱导生长锥塌陷，阻止轴突的再生。实验中我们对AD大鼠用姜黄素进行干预后，CRMP－2在大鼠海马内的表达显著上调，同时轴突蛋白表达明显增多，由此推断姜黄素可能通过CRMP－2来发挥对轴突生长的促进作用。

本研究提示姜黄素可部分改善Aβ1－40诱导的AD模型大鼠空间学习记忆障碍，其机制可能与提高CRMP－2的表达并抑制CRMP－2的磷酸化从而促进轴突再生有关。基于我们对姜黄素治疗AD动物模型的一系列研究，我们推测姜黄素是能够治疗AD且具有广阔前景的较好药物。

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