黄连等中药水煎剂对粪肠球菌的体外抑制作用

于静 戴东晓 谢景朝 李军如 陈惠珍

·论著·

黄连等中药水煎剂对粪肠球菌的体外抑制作用

于静 戴东晓 谢景朝 李军如 陈惠珍

目的比较黄连等6种中药水煎剂对粪肠球菌的体外抑菌效果。方法采用M－H琼脂稀释法检测6种中药水煎剂对32株粪肠球菌的体外抑菌作用，测定最小抑菌浓度(MIC)、MIC50、MIC90及累积抑菌百分率。结果浓度为1∶320(3.125 mg/ml)时，六种中药差异有统计学意义(P＜0.05)，黄连抑菌率明显高于其他组(χ2=56.74P=0.000)。浓度为1∶40(25 mg/ml)时，6种中药差异有统计学意义(P＜0.05)，五味子、大黄、黄连、连翘抑菌率高于乌梅、黄芩(χ2=8.381，P=0.004)，乌梅、黄芩二者差异无统计学意义(χ2=3.471，P=0.062)。浓度为1∶20(50 mg/ml)时，6种中药有统计学意义(P＜0.05)，乌梅抑菌率最低(χ2=33.52，P=0.000)。浓度为1∶10(100 mg/ml)时，6种中药差异无统计学意义(P＞0.05)，抑菌率均为100%。结论6种中药中黄连抑菌效果最好，乌梅、黄芩作用较弱。

根管消毒;粪肠球菌;中药;水煎剂;MIC

粪肠球菌(Enterococcus faecalis，E.faecalis)在治疗前的根管中并不是优势菌，但在根管消毒和充填后，其比例却大大提高，成为最常见的细菌种类。它在根管治疗后的根管中为优势菌，占发现细菌的24%～77%［1］。口腔内科治疗中使用的传统治疗方法，难以将定植于根管中的粪肠球菌彻底清除［2］，从而导致根管治疗后疾病的发生。近年来，如何抑制或杀灭根管内的粪肠球菌，提高根管治疗术的成功率逐渐成为学者们关注的焦点。因此，寻找新型根管消毒药物是满足口腔内科牙体治疗需要的必然趋势。本实验采用琼脂稀释法，选用五味子、大黄、黄连、乌梅、连翘、黄芩6种中药对32株粪肠球菌进行体外抗菌实验，以期对六种中药抗粪肠球菌性能作出初步评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂:五味子、大黄、黄连、乌梅、连翘、黄芩，以上品种的中药饮片，由河北医科大学第二医院提供，均购自河北省药材公司。0.9%氯化钠溶液(石家庄四药有限公司，批号:091019107)。Mneller-Hinton琼脂(简称M-H琼脂，美国BD公司生产)。粪肠球菌32株(石家庄市第二医院细菌室提供)，所有菌株分离鉴定均参照李仲兴编写的《诊断细菌学》［3］进行，必要时采用微生物鉴定药敏分析系统鉴定。

1.1.2 设备:Model LS-B75L-Ⅱ全自动立式蒸汽灭菌器(江阴滨江医疗设备有限公司)。多点接种仪(北京医科大学昆仑药物发展研究所生产)。电热恒温培养箱(山东省潍坊医疗器械厂)。微生物鉴定药敏分析系统(上海复星佰珞生物技术有限公司)。一次性使用细菌培养皿(直径为90 mm，江苏康健医疗用品有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 中药水煎剂溶液的制备:称取中药饮片五味子、大黄、黄连、乌梅、连翘、黄芩各50 g，每味药分别置砂锅中，加10倍量水浸泡过夜，后加热至沸，改用文火煎煮30 min，趁热滤过，滤渣另加8倍量水，同法煎煮30 min，滤过，合并两次滤液于烧杯中，水浴浓缩后放凉至室温，50 ml容量瓶定容，倒入广口瓶中，高压灭菌(0.1～0.11 MPa，121℃，15 min)，取出放凉备用，得每毫升相当于原药材1 g(1∶1)的中药水煎剂溶液。

1.2.2 药液稀释及含药血平板制备:取无菌试管11只，除第1、10号管外，于其余管中各加0.9%氯化钠溶液10 ml，于1号管、2号管分别加人1 g/ml中药水煎剂10 ml，2号管混匀后取出10 ml加入3号管，3号管混匀后取出10 ml放入4号管，如此连续稀释至9号管，从9号管取出的10 ml放入10号管，第10号管作无菌阴性对照管，第11号管只有0.9%氯化钠溶液，作无药阳性对照管。这样1～9号管均含有10 ml倍比稀释的药液，浓度分别为1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.82，3.91 mg/ml(即1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256)。

将已配好的无菌M-H琼脂(pH值为7.4)熔化，在无菌操作下吸取M-H琼脂16 ml置于三角瓶中，再从1号管中取出4 ml药液置于同一瓶中，摇匀，倒入平板，凝固后备用，得1号含药平板，含药量为200 mg/ml(1∶5)。2～11号平板的制备同1号，这样1～10号含药血平板的药物含量分别为200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.563，0.782，0.782 mg/ml(即1∶5，1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶140，1∶1280，1∶1280)，第10号含药平板作无菌阴性对照，第11号平板作无药阳性对照。

1.2.3 菌液制备及接种:将粪肠球菌新鲜培养物(菌落)用0.9%氯化钠溶液稀释制成菌悬液，浓度相当于0.5麦氏比浊管，经稀释后的受试菌在15 min内以多点接种仪接种，最终接种量为每点104 cfu，菌液接种于含药平板上，于37℃培养箱中培养24 h，观察并记录结果。每种药物的第10号平板不接种细菌，作无菌阴性对照;第11号平板不含药物接种细菌，作无药阳性对照。

1.2.4 最小抑菌浓度测定:观察含药平板的菌落生长情况，如果对照菌全部生长，则观察最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，以无细菌生长平板内药物的最小浓度为此药对该菌株的最小抑菌浓度即MIC。根据含药平板的菌落生长数及未生长数，统计药物抑制50%，90%细菌时的最小浓度，即MIC50，MIC90和累积抑菌百分率。

1.3 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 六种中药水煎剂对32株粪肠球菌的MIC、MIC50、MIC90及累积抑菌百分率结果见表1、2。第10号平板(无菌阴性对照)无粪肠球菌生长。第11号平板(无药阳性对照)粪肠球菌正常生长。

表1 6种药水煎剂对32株粪肠球菌的MIC、MIC50、MZC90

表2 6种药水煎剂对32株粪肠球菌的累积抑菌百分率%

表3 6种中药水煎剂对32株粪肠球菌的不同抑制作用(1∶320)

表4 6种中药水煎剂对32株粪肠球菌的不同抑制作用(1∶20)

表5 6种中药水煎剂对32株粪肠球菌的不同抑制作用(1∶40)

表6 6种中药水煎剂对32株粪肠球菌的不同抑制作用(1∶10)

2.2 6种中药水煎剂对粪肠球菌有不同程度抑制作用，同一种中药对粪肠球菌的不同菌株表现出相近的抑菌活性。黄连抑菌效果最好，其MIC90为1∶320(3.125 mg/ml)。浓度为1∶320 (3.125 mg/ml)时，6种中药差异有统计学意义(P＜0.05)。再经两两比较后得出黄连抑菌率明显高于其他组(χ2=56.74，P=0.000)。效果较好的有五味子、大黄、连翘，MIC90分别为1∶40(25 mg/ml)、1∶20(50 mg/ml)、1∶40(25 mg/ml);浓度为1∶40(25 mg/ml)时，6种中药差异有统计学意义(P＜0.05)。再经两两比较后得出五味子、大黄、黄连、连翘抑菌率高于乌梅、黄芩(χ2=8.381，P=0.004)。乌梅、黄芩作用较弱，二者差异无统计学意义(χ2=3.471，P=0.062)。且浓度为1∶20 (50 mg/ml)时，6种中药差异有统计学意义(P＜0.05)。乌梅抑菌率最低(χ2=33.52，P=0.000)。在固体培养基中，中草药水煎剂抑制粪肠球菌的效果随药液浓度的增加而增加。当浓度达到1∶10(100 mg/ml)时，各药物平板中均无菌落生长(P＞0.05)。6种中药抑菌率相同，均为100%。见表3～6。

3 讨论

多数中药及其复方制剂具有广谱抗菌、调节免疫、恢复人体微生态平衡、增强抗感染免疫、干预抗药性形成和转导、逆转抗药性的特点，这些优势让中药在临床应用中极具潜力。且中药水煎剂制备相对简便，不良反应小，不易产生耐药性，因此进一步将其用于临床是十分经济和安全有效的。有学者通过对肠球菌的体外抗菌活性检测发现五味子、黄连、乌梅和黄芩对肠球菌有较好的抑菌效果［4，5］;连翘为广谱抗菌药;大黄对肠球菌也有一定的抑菌效果［6］。与其他中药相比，黄连有其独特之处。因粪肠球菌属肠球菌属，以上研究为本实验选用此六种中药作为抑制粪肠球菌的实验药物提供了参考依据。也有学者将其中的一些药物应用于口腔及根管消毒，取得了较好的效果。但针对于抑制粪肠球菌的中药研究却很少见。本实验通过选取已被临床证实对多种病原菌有较好抑菌效果且具有代表性的6种中药(五味子、大黄、黄连、乌梅、连翘、黄芩)进行体外抗菌效果观察，发现其对粪肠球菌有体外抑制作用，其试验结果经检验具有统计学意义。这为临床根管消毒药物的选择提供了实验室依据，并且为口腔医学中药物的筛选提供了一种新的具有可行性和实用意义的研究方法。实验结果显示黄连水煎剂对粪肠球菌的抗菌作用优于其他参试中药，考虑与黄连的主要抑菌成分黄连素(小檗碱)有关。黄连素具有广谱抗菌作用，低浓度抑菌，高浓度杀菌。其作用机制可能是:(1)破坏细菌结构。(2)抑制细菌糖代谢，黄连能抑制酵母菌及细菌糖代谢的中间环节丙酮酸的氧化脱羧过程。(3)抑制核酸、蛋白质合成。

本实验参考王育红等［7］24种中药水煎剂对临床菌株的体外抑菌作用的药剂配制及实验方法。采用常规抑菌实验方法——琼脂稀释法，培养基选用M-H琼脂对六种中药进行定量抗菌实验研究。避免了普通的营养琼脂中所含某些成分会与中药的抗菌物质结合而抑制药物本身的抗菌作用，可大大提高抑菌实验的灵敏度，也更能精确地反映出6种中药对粪肠球菌的抑菌效果。并能够精确测出各种中草药的MIC值，达到精确筛选抗菌中草药的目的。

实验选用32株不同源临床分离粪肠球菌菌株。实验菌株是反映抗菌效果的重要指标。不同源菌株对抗菌药物耐药程度各不相同，与以往实验使用同源菌株不同，本实验具有多源性、多样性的特点，更接近临床情况，也更具有代表性和可重复性，使实验数据更加贴近临床，更能客观地反映出每种中药对临床粪肠球菌的抑菌效果。

通过本研究我们发现中药的不同提取方法对其抗菌效果有较大影响。这可能与中药的有效成分是水溶性还是脂溶性有关。同时各批次间药物本身质量的不稳定性也在很大程度上影响了药物浓度的精确获得，限制了其在临床上的应用。牙体牙髓疾病是混合细菌感染的过程，仅对其中某一种细菌有较强抗菌效果的药物在临床治疗中未必能达到理想的疗效，这也是我们将进一步研究的方向。

1 Stuart CH，Schwartz SA，Beeson TJ，et al.Enterococcus faecalis:its role in root canal treatment failure and current concepts in retreatment.J Endod，2006，32:93-98.

2 Reynaud Af，Geijersstam AH，Ellington MJ，et al.Antimicrobial susceptibility and molecular analysis of Enterococcus faecalis originating from endodontic infections in Finland and Lithuania.Oral Microbiol Immunol，2006，21:164-168.

3 李仲兴主编.诊断细菌学.第1版.香港:黄河文化出版社，1992.200.

4 苗明三，方晓艳.五味子多糖对正常小鼠免疫功能的影响.中国中医药科技，2003，10:100.

5 李仲兴，王秀华.应用M-H琼脂进行五倍子等5种中药对28株肠球菌的体外抗菌活性观察.中国中医药信息杂志，2004，11:1064-1066.

6 岳云升，李仲兴，王秀华，等.用新方法进行大黄对308株临床菌株抗菌活性研究.航空航天医药，2004，15:16-18.

7 王育红，李风学，张志清，等.24种中药水煎剂与免煎颗粒剂对临床菌株的体外抑菌作用.江苏中医药，2006，27:52-54.

R 187.1

A

1002－7386(2012)17－2580－03

10.3969/j.issn.1002－7386.2012.17.007

项目来源:河北省医学科学研究重点课题(编号:20110184)

050051 河北省石家庄市第二医院口腔科(于静、戴东晓、谢景朝、李军如);河北医科大学第二医院口腔科(陈惠珍)

陈惠珍，050000 河北医科大学第二医院口腔科; E-mail:yhzy359@126.com

2012－02－29)