双江古茶树与云南大叶种茶群体品种间的ISSR分析

吴 田，沈晓进 ，李法营 ，韦玲长 ，蓝增全

双江古茶树与云南大叶种茶群体品种间的ISSR分析

吴 田1，沈晓进2，李法营3，韦玲长4，蓝增全3

（1.西南林业大学 园林学院，云南 昆明 650224；2.昆明市农科院生物所，云南 昆明 650034；3.西南林业大学 环境科学与工程学院，云南 昆明 650224；4.临沧茶叶科学研究所，云南 临沧 677000）

采用ISSR分子标记技术对云南17份茶树样品进行了亲缘关系分析。实验结果表明，12条ISSR引物共产生193条扩增带，其中多态性条为100.0%。供试材料的遗传相似系数变异范围为0.50～0.88。通过UPGMA法，可将17份材料分为2个大类，第1大类为“红毛茶”，第2大类又可分成2个亚组，其中组Ⅰ包括双江古茶树和永德大叶种，而组Ⅱ包括勐库群体品种、勐海大叶种和部分凤庆大叶种。聚类分析结果表明，双江古茶树与采自永德的茶树亲缘关系最近，而与采自勐海和凤庆大叶种的亲缘关系相对较远。

大叶茶；种质资源；ISSR标记

云南大叶种茶是云南省大叶类茶树品种的总称，其代表是经国家认定的勐库大叶种、凤庆大叶种和勐海大叶种。据国家、省、地茶叶学者专家科考组2002年12月的初步结论，树龄2 700多年的双江自治县勐库野生古茶树群落，是迄今世界上已发现的海拔最高、分布面积最广、种群密度最大的野生古茶树群落。其中，1号大茶树位于海拔2 720 m处，株高16.8 m，基围3.25 m，胸围3.1 m，树幅13.7×10.6 m；另外一棵根基和株高都在1号大茶树之上的古茶树，因为这棵茶树是在考察组对古茶山科考后才发现的，先前就命名了1号大茶树，所以，便称它为 1+1号大茶树。近年来，虽然有不少报道是关于茶树亲缘关系的研究，但鲜有探讨双江古茶树与云南大叶群体品种间亲缘关系的的研究。

随着分子生物学的发展，基于PCR的分子标记如RAPD、AFLP 、SSR、ISSR等，被广泛应用于植物遗传研究[1-2]。ISSR 标记是采用17～22碱基的重复锚定引物扩增重复序列之间的片段，操作简单、重复性好、多态性丰富[3]，且一套ISSR引物可在多种作物中通用，利用率高，在遗传关系研究方面的应用前景更广阔[4]。用ISSR标记进行茶树进行分子鉴别的报道逐渐增多[5-7，8]。本实验采用ISSR技术探讨双江古茶树与云南大叶群体品种间的亲缘关系，以在今后育种及分类工作中在DNA水平提供证据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

样品主要采集自勐库、凤庆、勐海等3个茶区，叶面积、叶形指数、叶脉数、叶片特点、叶片颜色等特征详见表1。表1中的名称大多根据采集地命名，如“勐库”为勐库群体栽培品种，采集自勐库；“凤庆1”、“凤庆2”分别为采集自凤庆不同地点的两份材料。古茶树1～4均采自双江勐库镇大雪山，其中“古茶树2”为1号大茶树，“古茶树4”为1+1号大茶树，而“古茶树1” 和“古茶树3”为1号大茶树附近、植株较为矮小的、形态特征略有差异的茶树样品。古茶树1、2、3和4即为本实验所要探讨的双江古茶树。而“红毛茶”是当地认为是“野茶”的一种资源，且有研究者认为其与双江古茶树有一定的渊源，但目前还未见其进行详细的分类鉴定的资料。样品选无病虫害的茶树嫩叶，洗净后擦干，用液氮速冻，置于-70℃冰箱备用。

表1 用于本研究的云南大叶种茶种质†Table 1 Yunnan big-leaf tea germplasm resources used in the present study

1.2 主要试剂

CTAB提取介质：200 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)，l00 mmol/L EDTA(pH 值 8.0)，200 mmol/L NaCl；CTAB抽提缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl(pH 值 8.0)，20 mmol/L EDTA(pH 8.0)，350 mmol/L NaCl，3 % CTAB，2% β-巯基乙醇；SDS提取介质：100mmol/L(pH8.0)Tris-HCl，50 mmol/L EDTA (pH值8.0)，500 mmol/L NaCl。本实验所使用的试剂均为国产分析纯。

1.3 DNA提取

本实验用改良CTAB法提取DNA，即称取保存于-70 ℃冰箱茶树叶片于液氮中迅速研成粉末，取约0.2 mg转入2.0 mL 离心管中，加入1 mL CTAB提取介质，混匀，7 000 r/min离心5 min，除去上清；重复上述操作；在沉淀中加入1 m L 65℃的CTAB抽提缓冲液，混匀，65 ℃水浴1 h；7 000 r/min离心10 min，取上清液，转入另一离心管中，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液，充分混匀，至水相由绿色变为无色；10 000 r/min离心10 min，取上清液，转入另一离心管中，加入2倍体积-20 ℃预冷的无水乙醇，轻柔混匀；10 000 r/min离心10 min，将上清液缓慢倒出，用75%乙醇浸泡沉淀1 h后在超净工作台吹干至无酒精味，溶于适量1×TE缓冲液。

1.4 DNA检测

取5 μL DNA样品与3 μL上样缓冲液(loading buffer)混匀后点样于1% EB琼脂糖胶孔，电泳，用凝胶成像系统照相，保存，以检测DNA样品的完整性。根据电泳检测结果大致判断DNA浓度，将DNA稀释至合适倍数，用超微量分光光度计测定OD260/OD280、OD260/OD230和DNA样品浓度，以检测DNA样品的纯度和浓度。

1.5 ISSR引物筛选及ISSR-PCR扩增

根据加拿大British Columbia大学设计的ISSR引物序列，随机选择32条，由上海生工合成。PCR试剂均购自日本TAKARA公司。PCR反应液体系为20 μL，含10×PCR Buffer 2 μL，dNTP(A、T、C、G) 各 200 μmol/L，每条引物 1 μL (10 mmol/L)，Taq DNA聚合酶1 U，模板DNA 50 ng(提取自“红毛茶”)，不足体积用无菌超纯水补足。PCR反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；50 ～ 60 ℃（根据引物合成单上的Tm值分别试验，取最佳退火温度） 45 s；72 ℃ 1 min 30 s，40 个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物在1×TAE缓冲系统下用2.0%的加入溴化乙锭(EB)琼脂糖凝胶电泳分离，电泳完毕后在美国UVP凝胶成像系统上照像并保存。每组引物重复3次，以确认易于辨认、清晰且重复性好的条带。

1.6 数据分析

根据电泳条带的有无统计数据，在相同迁移位置，有带记为1，无带记为0。只记录易于辨认、清晰且重复性好的条带，排除模糊不清的条带。用NTsys 2.1e软件对茶树种质进行非加权组平均法UPGMA(Unweighted Pair Group Method Analysis)聚类分析，计算种质之间的遗传相似系数，建立树状图。

2 结果与分析

2.1 DNA质量检测

本实验采用改良CTAB法提取的云南大叶种茶树叶片基因组DNA用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测(图片未显示)，结果显示DNA主带清晰明亮，条带整齐，无拖带现象。经紫外分光光度计检测，DNA的OD260/OD280值在1.7～1.9之间， OD260/OD230值在1.9～2.1之间，表明该方法提取的总DNA质量比较高，纯度好，可以用于后续ISSR分析。

2.2 ISSR引物的筛选

以“红毛茶”基因组DNA为模板，对32条不同的随机引物进行了PCR扩增(图1)，发现有12条引物在相应的退火温度下(表2)能扩增出产物，其中引物840、844、847、848、866、856、827扩增的条带清晰，且多态性较高。

表2 用于本研究的ISSR引物Table 2 ISSR primers used in the study

图1 ISSR引物筛选Fig.1 Selection of ISSR primers

2.3 不同大叶茶种的ISSR-PCR扩增

分别用12个引物对17份样品进行ISSR-PCR扩增，结果表明扩增的条带大部分集中在100～1 000 bp，可读条带数共193条，多态性比率为100.0%。图2以引物847为例展示了其在17份样品中扩增的图片。

图2 引物847的ISSR扩增Fig.2 Agarose gels showing the ISSR profile generated by primer 847

2.4 聚类图的构建

采用UPGMA法构建了17份样品的遗传关系聚类图(图3)。通过聚类发现，17份样品的遗传相似系数变化范围为0.50～0.88，其中红毛茶单独聚类，与其它16份种质的亲缘关系较远。其余的16份种质明显聚为两组(组Ⅰ和组Ⅱ)，组Ⅰ包括采集自勐库的种质和部分采集自永德的种质，而组Ⅱ包括勐库群体品种“勐库”、采集自勐海的种质和采集自凤庆的种质。特别值得注意的是，古茶树1、2、3和4，即双江古茶树聚类较近，表明了它们较近的亲缘关系。而双江古茶树与“勐库”分别位于聚类图的两组中，且“勐库”与凤庆种亲缘关系最近，暗示着勐库群体品种并非源于当地。此外，通过聚类图还可以发现，古茶树1和古茶树3遗传距离最小，表明两者之间亲缘关系最近，且在本实验所用标记范围内、相似性系数为0.88时，这两种种质在DNA分子水平上是相同的，表明单纯从表观性状进行分类是有失偏颇的，更加暗示了分子技术在植物分类中的重要作用。总之，从聚类图可见，双江古茶树与采自永德的茶树亲缘关系最近，而与采自勐海的大叶种样本和凤庆的样本的亲缘关系相对较远。

3 讨 论

图3 17份茶树种质的UPGMA聚类Fig.3 UPGMA-based analysis among 17 Yunnan big-leaf tea resources

本研究中12条ISSR引物被用于双江古茶树与云南大叶群体品种间的亲缘关系分析，研究结果表明，16份云南大叶种茶树及1份“红毛茶”资源种质间DNA扩增谱带的多样性程度高达100%，这与刘本英[7]、邵婉芳[9]和段红星[10]研究云南茶树种质有相似结果。从聚类树状图可以看出供试种质分为2个大类，第1大类为“红毛茶”，第2大类又可分成2个组，组Ⅰ包括双江古茶树和永德大叶种，而组Ⅱ包括勐库群体品种“勐库”、采集自勐海大叶种和凤庆大叶种。从聚类图可见，双江古茶树与采自永德的茶树亲缘关系最近，而与采自勐海和凤庆的大叶种样本的亲缘关系相对较远。值得一提的是，“红毛茶”与双江古茶树聚类较远，这在分子水平为“红毛茶”与双江古茶树之间较远的亲缘关系提供了证据。

聚类分析也表明，来自凤庆和勐库的样本没有与地域相对较近的永德样本聚在一起，而与地域相对较远的勐海样本聚在一起，这主要可能因为茶树是高度杂合体，且为异花授粉植物，在长期杂交演化的过程中产生了大量的不连续变异，而且长时间移种后新环境对种质的遗传信息也可能发生一定影响。也不排除所采样本属于农业生产中勐海、凤庆、勐库三地引种栽培大叶种茶树的因素。此外，本研究发现，通过ISSR技术进行聚类分析的结果与通过叶片大小、叶脉数等传统植物学分类的结果不完全相同，暗示着分子生物学与茶树表观特征的结合更利于茶树分类的真实性和科学性。

致谢：本次实验的部分样品由云南农业大学茶学院熊能和李双荣同学采集，在此表示感谢！

[1] 陈兆波.分子标记的种类及其在作物遗传育种中的应用[J].现代生物医学进展, 2009, 9(11)： 2179-2181.

[2] 廉 勇, 陈源闽, 王 勇, 等.DNA分子标记技术辅助蔬菜育种研究进展[J].内蒙古农业科技, 2008, 5, 78-79.

[3] Prevost A, Wilkinson M J.A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars [J].Theor Appl Genet, 1999, 98： 107-112.

[4] Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D.Genome fingerprinting by Simple Sequence Repeat (Ssr)-anchored polymerase chainreaction amplification [J].Genomics, 1994, 20：176-183.

[5] 刘本英, 王平盛, 周红杰, 等.云南茶组植物ISSR-PCR反应体系的建立[J].云南农业大学学报, 2006： 21 -25.

[6] 姚明哲, 陈 亮, 王新超, 等.我国茶树无性系品种遗传多样性和亲缘关系的ISSR分析[J].作物学报, 2007, 33(4)： 598-604.

[7] 刘本英, 王丽鸳, 周 健, 等.云南大叶种茶树种质资源ISSR指纹图谱构建及遗传多样性分析[J].植物遗传资源学报,2008, 9(4)： 458-464.

[8] 华仁杏3个杂交组合F1子代遗传变异的ISSR分析[J].中南林业科技大学学报，2011，31（10）：100-104.

[9] 邵婉芳, 庞瑞华, 王平盛, 等.云南茶树种质的RAPD研究[J].中国农业科学 , 2003, 36(12)： 1582-1587.

[10] 段红星, 邵婉芳, 王平盛, 等.云南特有茶树种质资源遗传多样性的RAPD研究[J].云南农业大学学报, 2004, 19(3)： 246-254.

ISSR analysis between Shuangjiang ancient tea trees and Yunnan big-leaf tea trees

WU Tian1, SHENG Xiao-jin2, LI Fa-ying3, WEI Ling-chang4, LAN Zeng-quan3
(1.College of Horticulture and Gardening, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunan, China;2.Biotechnology Research Institute, Kunming Academy of Agriculture Science, Kunming 650034, Yunan, China;3.Lincang Tea Research Institute, Lincang 677000, Yunan, China;4.College of Environment Science and Engineering, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunan, China)

ISSR molecular markers were used to analyze the genetic polymorphism of 17 Yunnan big-leaf tea resources.The results show that 193 bands were amplified with 12 ISSR primers, and the polymorphic rate were 100.00 %.The genetic similarity of the materials varied between 0.50 and 0.88.The 17 materials were classified into 2 groups with UPGMA method, and the first group involed “Hongmao Tea”, and the second one included two subgroups.The subgroup Ⅰ included the Shuangjiang ancient tea trees and Yongde big-leaf, and the subgroup Ⅱ included “Mengku”, the Menghai big-leaf and parts of Fengqing big-leaf.The genetic relationship of the ancient tea trees from Shuangjiang and parts of Fengqing big-leaf tea was the closest, and that was more far relatively with Menghai big-leaf tea.

big-leaf tea; germplasm resources; ISSR marker

S794.9；S571.1

A

1673-923X(2012)03-0136-05

2011-12-30

国家林业局948项目(2011-4-45)；西南林业大学重点基金(110908)和西南林业大学“大型仪器设备共享基金”

吴 田(1980—)，女，山东青岛人，副教授，博士，主要从事植物生物技术及分子生物学方面的研究；E-mail：461257271@qq.com

蓝增全(1963—)，男，广东梅县人，教授，主要从事生态学和茶学方向研究；E-mail： 2351417655@qq.com

[本文编校：欧阳钦]