精子抗原肽的合成及其在酶联免疫吸附法检测抗精子抗体中的应用价值

白 玲 谢 琦 佘尚扬 夏红卫 刘永明，*

1.桂林医学院(541004);2.广西壮族自治区妇幼保健院

·技术与方法·

精子抗原肽的合成及其在酶联免疫吸附法检测抗精子抗体中的应用价值

白 玲1谢 琦1佘尚扬2夏红卫2刘永明1，*

1.桂林医学院(541004);2.广西壮族自治区妇幼保健院

目的:以合成精子抗原肽为抗原建立酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测抗精子抗体(AsAb)。方法:通过PS3全自动合成仪合成精子肽P10G、YLPl2和SP17抗原肽，经反相高效液相色谱(HPLC)纯化和质谱鉴定，分别包板制备ELISA试剂盒，并检测血清标本。结果:成功合成3种目的肽，质谱分析结果主峰分子量与理论值基本一致，HPLC结果显示其纯度为97.5%、97.78%和95.5%。以3种合成肽为抗原建立ELISA检测AsAb，与商品化试剂盒比较，均显示极好的一致性(Kappa值＞0.75)。结论:全自动固相多肽合成技术可用于高纯度的精子抗原肽合成，所合成的P10G、YLPl2和SP17抗原肽均具有较好的抗原活性，可作为ELISA的包被抗原用于AsAb检测。

精子抗原肽 抗精子抗体 固相多肽合成 酶联免疫吸附测定法

不孕不育原因很多，其中2% ～10%与免疫因素有关［1，2］，9% ～36%的不孕症夫妇存在抗精子抗体(AsAb)［3］。目前，血清中AsAb阳性已被列为人类免疫性不孕的确定指标之一。建立一种特异性强、灵敏度高、重复性好的AsAb 检测方法对临床免疫性不孕症的诊断和治疗至关重要。现常用的As-Ab检测方法为酶联免疫吸附测定法(ELISA)。研究表明，合成肽能够保持其生物活性及高度专一性的免疫原性［4］，故而研究应用人工合成肽作为抗原制备试剂盒检测抗体受到人们重视［5］。P10G(序列为PGGGTLPPSG)来自一个14kDa的兔精子自身抗原，O'Rand等［6］研究表明来自输精管结扎术的男性和不孕妇女的血清可与合成肽P10G发生免疫反应。YLP12(序列为YLPVGGLRRIGG)则是一段位于人类精子细胞顶体区域的肽序列，具有睾丸特异性，与人类精子和透明带的识别和结合有关［7］。精子蛋白17(SP17)是一种哺乳动物睾丸、精子特异性抗原，主要功能是参与精子的顶体反应，促进受精过程［8，9］。对天然人 SP17 的模拟表位研究发现:人SP17有两个免疫优势的线性B细胞表位(4～19aa和118 ～127aa)［10］。本文选择 118 ～127aa十肽序列(AVKIQAAFRG)作为SP17抗原肽进行人工合成。笔者曾手工化学合成了P10G，并成功建立检测AsAb的ELISA方法，具有较好的应用前景［11］。在此基础上，本文利用全自动固相多肽合成仪合成P10G、YLP12和SP17抗原肽，分别作为ELISA包被抗原检测免疫性不孕患者血清AsAb，探讨人工合成精子抗原肽作为包被抗原应用于ELISA检测AsAb的方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及材料

1.1.1肽合成主要试剂Rink amide－AM Resin、13种 Fmoc－氨基酸、哌啶、苯并三氮唑 － N，N，N＇，N＇－四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)均购自吉尔生化(上海)有限公司;N，N－二甲基甲酰胺(DMF)、N－甲基吗啉(NMM)、三氟乙酸(TFA)、苯甲硫醚、苯甲醚购自比利时的ACROS公司;二巯基乙烷购自美国Sigma公司;乙腈购自Fisher Chemicals公司;乙醚、甲醇为国产分析纯。

1.1.2血清标本由广西妇幼保健院检验科提供。

1.1.3 ELISA试剂酶标板为美国Corning Costar 96孔板，包被液为0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液;封闭液为 0.01mol/L、pH7.4 磷酸盐缓冲液(PBS)，内含20%灭活新生牛血清;样品稀释液为含20%灭活新生牛血清，0.05%Tween－20的PBS;洗涤液为含0.05%Tween－20的PBS。酶标抗体为辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG，底物四甲基联苯胺(TMB)购自华美转导科技有限公司。

1.2 主要仪器

PS3全自动固相多肽合成仪(Protein Technologies公司)，冷冻干燥机(Labconco公司)，多功能高速冷冻离心机(Eppendorf公司)，SPD－M20A型高效液相色谱仪(大连依利特有限公司)，酶标仪(美国BioRad公司)。

1.3 方法

1.3.1精子抗原肽的固相合成、纯化及鉴定在PS3全自动固相多肽合成仪上，以N－α－Fmoc保护的氨基酸为原料，Rink氨基树脂为载体，HBTU为肽键缩合剂，采用固相多肽合成技术，从C端到N端按己知序列依次偶联合成(图1)。合成结束，取下反应瓶，在通风橱中用DMF将反应瓶中的肽－树脂全部冲到Poly－Prep层析柱中，用甲醇冲洗树脂除去DMF。氮气吹干后，加入裂解液于室温下振荡反应2h;反应结束用离心管收集反应液，氮气小心吹去反应液中的TFA至反应液余2ml左右。加入－20℃无水乙醚沉淀30min;离心收集沉淀;最后用氮气吹去乙醚，即得合成肽粗品。合成肽粗品经高效液相反相层析柱C18分离纯化，收集主峰冷冻干燥后，得到反相高效液相色谱(RP－HPLC)纯化的合成肽。对纯化后的合成肽进行电喷雾质谱(ESI－MS)鉴定，将质谱分析的荷质比与预测的理论分子量进行比较。再经RP－HPLC分析合成肽纯度。

图1 Fmoc固相多肽合成过程

1.3.2酶联免疫吸附试剂盒的制备用包被缓冲液将精子抗原肽作系列稀释，分别以1、5、10、20μg/ml的浓度包被酶标板，经棋盘方阵滴定法选择包被抗原的工作浓度。将精子抗原肽稀释至最适包被浓度，酶标板每孔加入100μl，置4℃48h。洗涤3次。拍干后每孔加封闭液350μl，置4℃24h，洗涤5次。室温干燥后封袋4℃保存。每孔加入100μl预先用样品稀释液稀释100倍的血清标本，置37℃水浴恒温箱保温1h，洗涤5次后甩干。每孔加入100μl工作浓度的酶标抗体(羊抗人IgG－HRP)，置37℃水浴恒温箱保温1 h，洗涤5次后甩干。每孔加入100μl TMB底物溶液，置 37℃水浴恒温箱保温15min。最后每孔加入1mol/L H2SO450μl终止反应，在酶标仪上(波长450nm)测定每孔的吸光度。临界值为阴性对照平均值的2.1倍。

1.3.3血清标本的检测用上述方法自制的ELISA试剂盒检测血清标本，与南京欣迪生物药业工程公司生产的抗精子抗体(IgG)ELISA检测试剂盒的测定结果进行对比。分别测定AsAb阳性血清40例，阴性血清50例。

1.4 统计学处理

使用SPSS11.5统计软件进行统计分析，采用Kappa系数作为两种检验方法一致性的检验指标。

2 结果

2.1 精子抗原肽的纯度分析和质谱鉴定

纯化后的精子抗原肽P10G、YLP12和SP17通过RP－HPLC分析，经积分计算各主峰面积，纯度分别为 97.5%、97.78% 和 95.5%(图 2)，提示均为高度纯化的合成肽，可以满足ELISA实验作为包被抗原的需要。ESI－MS法对纯化后的P10G、YLP12和SP17抗原肽冻干品进行分子量鉴定。ESI－MS分析显示分子量分别为 836.99，1 255.69和1 060.60，与三者理论分子量(分别为 837.80、1 256.45和1 060.27)均相吻合(图3)，证明纯化后的合成产物为目的精子抗原肽。

2.2 ELISA试剂盒包被检测条件

以合成的P10G、YLP12和SP17抗原肽分别作为包被抗原制备 ELISA试剂盒，检测血清 AsAb(IgG)，经棋盘方阵滴定法确定各抗原肽的最适包被浓度为5mg/L。

2.3 血清标本检测对照实验

以南京欣迪生物药业工程公司生产的AsAb(IgG)ELISA试剂盒的检测结果作为标准对照，测定结果及统计处理结果见表1。

P10G包被检测特异性为100%，灵敏度为77.5%，两种检验方法符合率为90%，Kappa值为0.79;YLP12包被检测特异性为100%，灵敏度为75%，两种检验方法符合率为89%，Kappa值为0.77;SP17抗原肽包被检测特异性100%，灵敏度为85%，两种检验方法符合率为93.3%，Kappa值为0.87。

表1 包被试剂盒与商品试剂盒测定结果的比较

3 讨论

检测AsAb是诊断免疫性不育症及观察其治疗效果的常用方法，目前用于AsAb检测的ELISA试剂盒通常是利用有正常生育能力者的精子直接提取抗原，或者普通合成肽抗原包被酶标板，但其抗原来源受到限制，且稳定性和重复性不理想;或者由于合成肽肽段比较短小，在包被过程中容易造成表位无法完全呈现，而影响检出率，导致假阴性。于是一种易得、稳定的精子抗原成为需要［12，13］。人工合成多肽抗原相比其他抗原成分明确，有较高的敏感性和特异性，而且制备简单、快速，生产中不存在生物安全问题，还可以去除传统抗原的毒性片段，提高抗原肽的安全性;或进一步重组免疫增强序列以提高抗原性。人工合成肽作为ELISA试剂盒的包被抗原，因其分子量小、结构简单、纯度高而无其它蛋白成分，明显提高检出的特异性和敏感性而受到青睐，并且因其抗原成分明确，适于检测试剂盒的标准化。

本文采用Fmoc法固相多肽自动合成技术，成功合成了P10G、YLP12和SP17特异性精子抗原肽，经高效液相纯化分析，纯度高达97.5%、97.78%和95.5%;纯化后的精子抗原肽经ESI－MS分析，证明合成并纯化所得的物质为目的精子肽。用所合成精子肽P10G、YLP12和SP17抗原肽分别包被酶标板，建立ELISA试剂盒检测已知AsAb阳性、阴性血清标本，与商品化的AaAb ELISA检测试剂盒检测结果比较，总符合率均大于或接近90%。Kappa值为0.79、0.77 和0.85，表明这两种方法的检验结果具有极好的一致性。这说明所合成的3个肽段均有较好的抗原活性，可以以此为基础进一步探索优化检测AaAb的ELISA试剂盒。

由于合成肽片段较短，且肽段的空间结构与天然蛋白的空间结构有可能不完全一致，多表现为线性表位，故对检测的结果可能有一定的影响。如采用多个抗原肽混合包被而可以同时包含多个抗原表位，或进一步与重组蛋白混合包被，可能会提高检出率。本研究对以合成多肽为抗原的AaAb检测ELISA法做了初步探讨，对AsAb检测方法的改进和包被用抗原的标准化有重要意义，可以进一步筛选出更高敏感性抗原肽段或肽段组合作为检测用抗原，以提高检测的敏感性，满足临床检验需求。

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Synthesis of sperm antigen peptides and its application in detection of antisperm－antibodies

Bai Ling1，Xie Qi1，She Shangyang2，Xia Hongwei2，Liu Yongming1，*
1.Guilin Medical University，Guilin541004;2.Maternal and Child Health Hospital of GuangxiCorresponding author:Liu Yongming，E－mail:liuym@glmc.edu.cn

Objective:To synthesize sperm peptides for establishment of the enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)to detect antisperm－antibodies(AsAb).Methods:The sperm peptide P10G，YLPl2 and SP17 were synthesized by the PS3 automated solid phase peptide synthesizer，purified by RP－HPLC and identified by mass spectrum(MS).With the synthetic peptide as a coating antigen，the ELISA method was used to detect serum concentration of AsAb.Results:The molecular weights of three synthesize peptides identified by MS were in good agreement with calculated molecular weights.The purity of the synthetic peptides purified by HPLC was 97.5%，97.78%and 95.5%.AsAb was detected by the indirect ELISA based on the peptide compared with the commercial kit，and results showed that both assays were unanimous with Kappa value more than 0.75.Conclusion:Automated solid －phase peptide synthesis could be used to synthesize high purity sperm antigen peptides.The synthesized peptide P10G，YLPl2 and SP17 show high antigenic activities and can be used as a coating antigen for indirect ELISA to detect AsAb.

Sperm antigen peptide;Antisperm－antibody;Solid－phase peptide synthesis;Enzyme－linked immunosorbent assay

10.3969/j.issn.1004 －8189.2012.08

广西壮族自治区科技厅科学研究与技术开发项目(桂科攻0632007－1I)

2011－11－04

2012－01－28

*通讯作者:liuym@glmc.edu.cn

［责任编辑:张 璐］