MLPA技术用于产前DMD基因诊断的应用探讨

吴建力 杜华荣 尹耕心 吴玉鹏 傅克勤

安徽省计划生育科学技术研究所(合肥，230031)

MLPA技术用于产前DMD基因诊断的应用探讨

吴建力 杜华荣 尹耕心 吴玉鹏 傅克勤*

安徽省计划生育科学技术研究所(合肥，230031)

假肥大性肌营养不良症是一种严重的神经肌肉疾病，分为杜氏肌营养不良症(DMD)和贝氏进行性肌营养不良症 (BMD)，均是由于 DMD基因(Xp21.2)突变所致［1］。由于本病目前无有效的治疗方法，产前诊断成为控制致病基因传递、防止患儿出生及降低发病率的主要措施。本研究对DMD产前诊断家系中具有高患病风险的2个胎儿，提取其羊水基因组DNA，采用多重连接探针扩增技术(MLPA)进行产前基因诊断的探索。

1 资料与方法

1 1 一般资料

2例均为进行DMD基因诊断，经MLPA技术确诊为DMD基因外显子缺失者，其母亲再次妊娠，经超声性别检查胎儿均为男性，有50%患DMD风险，要求对胎儿进行DMD基因产前诊断。对标本的使用均知情同意。

1.2 方法

1.2.1基因组DNA提取采集2例患儿及父母外周静脉血3～4ml至含EDTA抗凝剂的采血管中。抽取孕16～22周妇女羊水20ml，均使用基因组DNA提取试剂盒(QIAamp Blood DNA mini Kit)抽提DNA，加入适量的TE液，充分溶解DNA，紫外分光光度计测定DNA纯度和浓度。将DNA浓度控制在50 ～200ng/μl，－20℃保存。

1.2.2 MLPA检测MLPA检测试剂盒 P034/P035购自MRC Holland。①基因组DNA变性和SALSA MLPA探针杂交:取约100ng(3μl)的基因组DNA，将其95℃变性5min，25℃保温，然后向变性后的DNA中分别加入MLPA探针混合物和MLPA缓冲液，小心混匀，95℃ 孵育1 min，60℃过夜杂交15h以上。②连接反应:冷却至54℃后，再加入连接缓冲液A、B和连接酶，小心混匀，54℃孵育15min，98℃加热5 min终止连接反应，4℃保温。③PCR反应:由SALSA FAM PCR引物、SALSA PCR缓冲液、水和SALSA聚合酶配制的SALSA PCR体系9.8μl中加入 2.7μl连接产物，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃60s，循环35次，72℃延伸20min。④毛细管电泳检测:0.5μl PCR 产物与 0.15μl Genescan LIZ500 和10μl去离子甲酰胺混合，在ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer上经36cm毛细管电泳分离，温度控制在60℃。3130 Data Collection Software(Applied Biosystems)收集数据，用GeneMapper ID v3.2软件进行数据分析。每次MLPA检测都包括一个正常的对照样本，检测结果均经过2次独立的实验证实。

2 结果

采用SALSA probe mix P034和P035两套探针可同时检测DMD基因79个外显子缺失型和携带者。

2.1 家系1

见图1、图2。先证者(患病者)是DMD 45号外显子缺失突变，母亲为携带者:45号外显子杂合缺失突变，胎儿为一正常男性胎儿。

2.2 家系2

见图3，图4。先证者是DMD 46～53号外显子缺失突变，母亲为DMD 45～53号外显子杂合缺失突变，胎儿为一正常男性胎儿。

3 讨论

假性肥大性肌营养不良为性染色体隐性遗传。DMD患者一般有典型临床表现和家族史，约1/3为散发型，男性患病，女性携带。BMD起病较晚，症状较轻且进展缓慢，多在16岁之后靠轮椅生活，寿命可达40～50岁。血清生化检测是确定DMD/BMD携带者及患者的传统方法，肌酶在疾病早期和进展期均明显增高，尤以血清肌酸磷酸激酶最敏感。随着分子生物学技术的发展，对疑似DMD进行准确的基因诊断可以避免误诊和误治，给患者提供更加详细准确的优生优育指导。

1868年Duchenne首次描述此病，同年Monaco等首次将DMD基因定位于Xp21.2，1987年Koenig等克隆了整个DMD基因约14kb的cDNA。DNA全长为2.4Mb，RNA 全长为 14.2Kb，含有 79 个外显子，占X染色体全长的1.5%，包含79个外显子和78 个内含子，是目前发现的人类最大的基因［2，3］。在DMD基因内存在许多重复序列，有许多断裂和交换热点，导致基因缺失/重复极容易发生新生突变。DMD基因具有突变长度不一、突变位置无固定规律等特点，突变无明显种族、地理差异，突变中以外显子缺失突变最常见(55% ～65%)［4］。

White等［5］2002年设计了多重可扩增探针杂交技术(MAPH)，同年 Schouten等［6］在 MAPH 技术的基础上又发展了一种快速简单的检测技术，即MLPA。MLPA可以用2套引物通过2次 PCR检测DMD基因79个外显子缺失或重复，具有需要DNA量小、灵敏度高和重复检测的优点，是一种检测DMD/BMD基因大片段缺失/重复的快速可靠方法，通过直观图谱进行检测结果分析［7］。变性高效液相色谱(DHPLC)对DMD的基因缺失重复进行检测，其他还可以利用高分辨溶解曲线、基因芯片、免疫组化等方法检测DMD基因的突变类型［8］。

由于DMD涉及基因突变类型多，不同家系的突变类型可完全不同，需采用不同基因诊断方法和策略，因此在拟开展DMD的产前诊断之前必须首先完成家系中先证者的临床确诊和基因诊断，进行产前基因诊断才有意义。本所现阶段仅对DMD外显子缺失突变的先证者家系中具有髙致病风险的胎儿运用MLPA技术进行产前基因诊断。通常先运用MLPA技术检测先证者及家系中其他患者的DMD基因所有外显子，在明确存在DMD基因缺失型突变，确定缺失外显子片段后，再对家系中的高风险致病胎儿进行针对同一片段的基因诊断。本文通过对2个家系的基因诊断，2个家系中的高致病风险胎儿检测均未见DMD外显子明显缺失后，先证者母亲继续妊娠至胎儿分娩，取婴儿血液经MLPA检测证实与用羊水的检测结果一致。婴儿经产科及儿科医生体检，未见明显异常临床表现。进行血清酶学检查及后期随访，也没有发现异常临床体征。如DMD外显子筛查未发现缺失位点，则需开展先证者、先证者父母及家庭其他成员的DMD基因连锁标志分析，确定家系突变DMD基因类型，而后建立相应的基因诊断技术［9，10］。这是本所下一阶段争取开展的项目研究，不仅可以降低发病率，而且可以检测胎儿是否为基因携带者，从而有效控制致病基因的传递。

1 Francesco Muntoni，Silvia Torelli，Alessandra Ferlini，et al.Dystrophin and mutations:one gene，several proteins，multiple phenotypes［J］.The Lancet Neurology，2003，2(12):731 －740.

2 Monaco AP，Neve RL，Colletti－ Feener，et al.Isolation of candidate cDNAs for portions of the Duchenne muscular dystrophy gene ［J］.Nature，1986，(6089)323:646 －650.

3 Koenig M，Hoffman EP，Berteison CJ，et al.Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy(DMD)cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals［J］.Cell，1987，50(3):509 －517.

4 Mendell J R，Buzin CH，Feng J，et al.Diagnosis of Duchenne dystrophy by enhanced detection of small mutations［J］.Neurology，2001，57:645－650.

5 White S，Kalf M，Liu Q，et al.Comprehensive detection of genomic duplications and deletions in the DMD gene，by use of multiplex amplifiable probe hybridization［J］.The American journal of human genetic，2002，71(2):365 －368.

6 Schouten JP，McElgunn CJ，Wanijer R，et al.Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation－dependent probe amplification［J］.Nucleic Acids Resarch，2002，30(12):1 －13.

7 吴玉鹏，吴德，尹耕心，等.MLPA和PCR－RFLP技术用于脊髓性肌萎缩症的基因诊断［J］.中国计划生育学杂志，2008，16(9):535－539.

8 古艳，谢建生，韩春锡，等.应用多重连接依赖探针扩增技术对脊髓性肌萎缩患者及致病基因携带者进行基因诊断［J］.中华临床医师杂志(电子版)，2010，4(9):1512 －1519.

9 蒲祥元，金帆.Duchenne型肌营养不良症的植入前遗传学诊断［J］.国际生殖健康/计划生育杂志，2009，28(5):324 －325.

10 LI Q，Li SY，Hu DG，et al.Prenatal molecular diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophy［J］.北京大学学报(医学版)，2006，38(1):53 －56.

2012－05－11

2012－07－06*

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［责任编辑:张 璐］