蛹虫草蛋白质的碱法提取工艺

李晨曦，范青生，姜兴华，余宙

(南昌大学中德联合研究院，江西南昌，330047)

蛹虫草(Cordyceps militaris)，又名北冬虫夏草，蛹草，蛹草菌等，为卫生部公布的新资源食品，分类学上属于真菌门(Eumycota)，子囊菌亚门(Ascomycotinia)，核菌纲(Pyrenomycetes)，球壳目(Sphaeriales)，麦角菌科(Claviciptiaceae)，虫草属(Cordycps)［1］。研究表明蛹虫草含有丰富的蛋白质，有的甚至高达39%，人体必需氨基酸的种类齐全、比例适当，占氨基酸总量的 35.47%;同时含有 VA，VB2，VE，VC，VB1，VD，VB6和菸酸［2］，以及含有虫草素、虫草多糖、腺苷、甘露醇、麦角甾醇等药理成分［3］。临床研究表明，蛹虫草具有免疫调节、抗疲劳、抗肿瘤［4-5］、抗衰老、耐缺氧、降血压、降血脂、镇静催眠、保护心脑组织等药理作用［6-7］。

蛹虫草的粗蛋白含量在30%左右，而对蛹虫草相关产品的开发主要是利用其虫草素、腺苷等功效成分，对于蛹虫草蛋白质的提取性研究报道及市场上出现的针对蛹虫草蛋白进行研究开发的产品却并不多见，本文采用响应曲面法对蛹虫草蛋白质的提取进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

蛹虫草子实体，惠州市鑫福来实业发展有限公司;牛血清蛋白标准品，广东市齐云生物技术有限公司，纯度≥97%;考马斯亮蓝G250，上海强顺化学试剂有限公司;NaOH、乙醇、85%H3PO4、HCl，天津市永大化学试剂开发中心，分析纯。

DFT-200型中药粉碎机，温岭市林大机械有限公司;AR2140型分析天平，奥豪斯公司;DK-S 24型电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司;PB-10型pH计，德国赛多利斯;TL-04型离心机，北京路科顺科技发展有限公司;KDY-9820凯氏定氮仪，厦门精艺兴业公司;普析通用T6新世纪紫外分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 分析测定

(1)粗蛋白含量的测定［8］:凯氏定氮法。

(2)蛋白质检测:Bradford 检测方法［9］。

将提取液稀释10倍，取0.25 mL的提取液，补充水到1 mL，加入5.0 mL考马斯亮蓝G250试剂，摇匀静置10 min，在紫外分光光度计595 nm波长下测定吸光值，计算蛋白得率:

蛋白得率/%=(提取液中蛋白质的质量/原料蛹虫草的质量)×100

1.2.2 蛹虫草蛋白提取工艺

将蛹虫草子实体粉碎成粉末，过80目筛，用一定量一定浓度NaOH溶液浸提一段时间后，在3 500 r/min条件下离心30 min。取滤液透析后调节等电点，在3 000 r/min条件下离心20 min得沉淀。将沉淀进行真空冷冻干燥得到粗蛋白。

1.2.3 蛋白提取工艺优化

1.2.3.1 单因素实验

确定碱液浓度、提取时间、提取温度、料液比4个因素，每个因素进行6水平梯度处理，以蛋白得率为指标进行单因素实验研究分析。

1.2.3.2 Box-Behnken实验

在单因素实验的基础上，确定三因素三水平的最佳参数进行响应曲面分析。

2 结果与讨论

2.1 原料蛹虫草中粗蛋白的含量

经过凯氏定氮法测定所选取的蛹虫草中粗蛋白的含量为28.7%。

2.2 牛血清蛋白标准曲线

图1 牛血清蛋白标准曲线

结果表明，蛋白吸光度值在15～150 μg/mL浓度内线性关系良好，回归方程为:Y=5.413 8X+0.036 2，R2=0.997 9。

经过精密度实验、稳定性实验、重复性实验、加样回收率实验表明，该方法用于测定蛹虫草中的蛋白质含量可靠、稳定。

2.3 单因素实验结果与分析

2.3.1 NaOH溶液的浓度对蛹虫草蛋白得率的影响

图2 NaOH溶液的浓度对蛹虫草蛋白得率的影响

由图2可知，随着碱液浓度的不断增加，蛋白提取的效果增强。当碱液浓度到达0.15 mol/L时，蛋白质的得率最大达到8.56%，而当碱性过强时，会导致蛋白质变质使其得率下降。故在其他工艺条件一定的情况下，综合考虑产量与质量等因素，蛋白质得率在NaOH溶液浓度为0.15 mol/L的条件下最佳。因此选取0.1，0.15，0.2 mol/L 3个水平为考察因素。

2.3.2 浸提时间对蛹虫草蛋白得率的影响

由图3可知，提取时间较短时，蛹虫草粉不能与NaOH充分接触，蛋白质不易分离，从而提取物少，随着提取时间的延长，蛋白的提取率会不断增加。在120分钟时最大，得率为8.21%。此后随着时间的增加，对蛋白提取率的影响不显著，说明蛋白质已经充分溶出。因此选取90，120，150 min 3个水平为考察因素。

图3 浸提时间对蛹虫草蛋白得率的影响

2.3.3 料液比对蛹虫草蛋白得率的影响

图4 料液比对蛹虫草蛋白得率的影响

由图4可知，随着料液比的提高，蛹虫草的蛋白提取率明显升高，当料液比达到1∶17.5时，蛋白得率最高为8.66%，因此选取 1∶15，1∶17.5，1∶20 三个水平作为考察因素。

2.3.4 提取温度对蛹虫草蛋白得率的影响

图5 提取温度对蛹虫草蛋白得率的影响

由图5可知，温度在一定范围内对蛋白质的提取有促进作用，当提取温度低于50℃，蛋白得率随温度的升高而升高，而当温度在50～70℃时，其对蛋白质的提取率影响不大，50、60、70℃的提取率分别为8.43%、8.56%、8.61%，温度超过70℃时，蛋白提取率逐渐降低，可能是温度过高，使溶液的粘度变大，分子的运动速度减慢，阻止蛋白质溶解到溶液中，从而使提取率下降。而且，蛋白质在长时间热的影响下易变性，由于疏水基团的暴露和展开，蛋白质分子聚集，使蛋白质溶解度下降，导致蛋白提取率下降。从工业生产节省资源和生产力的角度考虑，固定选取60℃，进行之后的响应曲面实验，不对其进行与其他因素的进一步交叉优化实验。

2.4 响应曲面分析法优化提取工艺

单因素实验后，选取碱液浓度、料液比、浸提时间3个条件进行Box-Behnken实验，分别以A、B和C代表，每个自变量的低、中、高试验水平编码分别为-1、0、1(见表1)。

表1 试验因素水平及编码

表2 Box-Behnken试验设计以及蛋白得率的实测值与预测值

利用Design Expert软件，通过对表2中的数据分析得到蛋白得率试验数据进行多元回归拟合，获得蛹虫草蛋白得率对编码自变量的二次多项回归方程:

蛹虫草蛋白得率(Y)/%=8.65-0.42A-0.49B-0.11C+0.79AB-1.08AC-0.18BC-2.03A2-0.73B2-0.53C2。

表3为回归分析结果，由该模型的方差显著性分析可知，本试验所选用的二次多项模型具有极高的显著性(PModel＜0.000 1)，失拟项不显著，其校正决定系数)为0.984 8，表明有约98.48%的蛋白得率变化能由此模型解释。相关系数(R2)为0.993 4，表明碱法提取蛹虫草蛋白得率的实测值与预测值之间具有较好的拟合度，可用于碱法提取蛹虫草蛋白质的分析和预测。

表3 蛋白得率回归方程显著性检验

回归方程中各因素的系数值可以直接反映各试验因子对指标值的影响程度，F值越大，表明该因素越重要。从表3可以看出，影响碱法提取蛹虫草蛋白得率主次顺序为:料液比＞碱液浓度 ＞浸提时间。

根据回归方程做出响应曲面分析图(图6～图8)，考察所拟合的图形的形状，分析碱液浓度、料液比、浸提时间对蛹虫草蛋白质的提取得率的影响。

图6 碱液浓度和料液比交互影响蛹虫草蛋白得率的曲面图

从图6可以看出，随着碱液浓度的增大和料液比的提高，蛋白得率也随之增大，达到一个最高点后，又逐渐减小。从图7、图8可以看出，浸提时间和碱浓度以及浸提时间和料液比有着同图6一样的趋势，这也说明所要找的最佳浸提时间、碱液浓度和料液比都在设定的试验范围内。图6～图8表明，该模型在试验范围内存在稳定点，且该稳定点是最大响应值。

图7 浸提时间和碱液浓度交互影响蛹虫草蛋白得率的曲面图

图8 浸提时间和料液比交互影响蛹虫草蛋白得率曲面图

分析得到，碱法提取蛹虫草蛋白质的最佳工艺条件为，提取时间128 min，料液比1∶16.2，NaOH 溶液的浓度0.14 mol/L。试验重复3次，验证蛋白质的得率为88.92 mg/g与预测值88.19 mg/g接近。充分验证了所建模型的正确性。

3 结论

采用碱法提取蛹虫草蛋白，通过单因素实验和Box-Behnken中心组合设计原理，依靠响应曲面分析优化提取工艺，拟合了浸提时间、料液比和碱液浓度3个因素对蛹虫草蛋白得率的回归模型，通过验证该模型能够较好预测蛹虫草蛋白得率。得到最佳的提取条件，提取时间128 min，料液比1∶16.2，NaOH 溶液的浓度0.14 mol/L，在此条件下实验得到蛋白得率为88.92 mg/g。

［1］ 吴荣荣.蛹虫草活性成分分析［J］.现代农村科技，2010(19):60.

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