由L-精氨酸发酵液制备结晶型精酮合剂

李琪倩，李恒，陆震鸣，许泓瑜，方佳茂，许正宏，孙志浩，史劲松

1(江南大学医药学院，江苏无锡，214122)2(广东环西生物科技股份有限公司，广东普宁，515300)

L-精氨酸-α-酮戊二酸盐(L-arginine-α-ketoglutarate，AAKG)，简称精酮合剂，是由 L-精氨酸(L-Arg)与α-酮戊二酸(α-KG)络合形成的氨基酸盐，可以从溶液中以盐的形式结晶析出。在不同的结晶条件下，AAKG可以形成单精氨酸酮戊二酸盐(MAAKG)和双精氨酸酮戊二酸盐(DAAKG)两种形式，目前研究和应用较多的主要是MAAKG，其晶型为无色棱柱状，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于丙酮、乙醚等，在水溶液中能够完全解离为L-精氨酸和α-酮戊二酸。本文研究的AAKG均指MAAKG，其结构式如下:

AAKG不仅兼具L-精氨酸和α-酮戊二酸的生理功能，而且可以作为功能性营养强化剂和护肝药物应用于临床，主要用于增强体格、促进肌肉的快速增长和创伤恢复［1－3］，促进肝细胞对营养和能量的代谢，增强力量和精力，其生理机制在于AAKG能够在短期内提高体内NO的水平，增强蛋白质同化作用。目前，AAKG作为功能食品在国际市场上销量日益增加，并与鸟苷酸酮戊二酸盐(OKG)一起，在医学、营养、运动领域备受重视。

AAKG的制备工艺主要有3种方式:1是直接混合法，是将等摩尔的L-精氨酸、α-酮戊二酸粉末进行简单的混合而成，其制备方法简单，成本较低，是商品化生产最为通用的方法。但该法生产的AAKG不是结晶型产品，二者之间没有盐键结合，产品质量受到原料的品质、混合的均匀度影响;2是冻干法，先将L-精氨酸、α-酮戊二酸粉末进行等摩尔混合并溶解，再将溶液冷冻干燥成为冻干粉，该工艺能够得到相对稳定的结晶型AAKG，但存在晶型不可控、冻干过程能耗大等问题，一般仅适合 AAKG 注射剂生产［1－2，4］;3是结晶法，一般是将L-精氨酸、α-酮戊二酸按比例混溶后，通过溶液浓缩，加入有机溶剂、降低温度等方法，使AAKG以晶体形式析出，其产品纯度高，质量可控。相比而言，混合法和冻干法，在制备过程中不能够去除原料带入的杂质，对原料品质有着较高的要求，而结晶工艺是一个能有效去除杂质的精制过程，因而能够使用纯度相对较低的原料，甚至是低浓度的发酵液。本文在研究结晶法制备AAKG工艺基础上，直接利用 L-Arg发酵液为原料，进行结晶型AAKG的制备。由于制备路线可以绕开L-精氨酸提取环节的离子吸附、洗脱、浓缩和结晶操作，因而具有工艺流程简捷、综合成本低等优点。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

L-精氨酸(L-Arg，医药级)，购自上海斐雅科技发展有限公司;α-酮戊二酸(α-KG，医药级)，购自武汉银河化工有限公司。检测使用的标准品购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

电热恒温水槽(DK-80)，上海精宏实验设备有限公司;旋转蒸发器(RE-52A)，上海亚荣生化仪器厂;型真空干燥箱(DZF-6050)，上海博迅实业有限公司医疗设备厂;液相色谱仪(Dionex UltiMate 3000)，美国戴安公司;5L自动控制发酵罐(Biotech-2001)，上海保兴生物设备工程有限公司。

1.3 AAKG结晶工艺研究

1.3.1 基本步骤

在50 mL，0.5～1.0 mol/L的L-Arg溶液中，缓慢加入一定量的α-KG粉末，搅拌使其完全溶解，减压浓缩至浓度为1.5～3.0 mol/L。浓缩液以一定速率缓慢降温，置于5～15℃下恒温结晶24～48 h。待结晶完全后，分离晶体，并用少量冷乙醇淋洗晶体2～3次，置于40℃下真空干燥得到结晶型AAKG。

1.3.2 L-Arg和α-KG的混溶比例对AAKG晶体组成影响

研究上述制备工艺中α-KG与L-Arg的混溶比例，分别考察 α-KG:L-Arg 为 0.8、1.0、1.2、1.4、1.6时，结晶形成的AAKG晶体中L-Arg和α-KG的摩尔比影响。

1.3.3 起晶浓度对AAKG晶体收率和晶体纯度的影响

减压浓缩L-Arg与α-KG混合溶液，控制不同的浓缩比例，分别考察 1.25、1.5、2.0、2.5、3.0(mol/L)溶液浓度对AAKG的结晶产率、晶体纯度及晶体组成的影响。

1.3.4 降温速率和结晶温度对AAKG晶体收率和晶体纯度的影响

分别考察5、10和15℃下AAKG的结晶收率和晶体纯度情况，并比较快速降温结晶(10℃/h)和缓慢降温速率(2℃/h)对晶体结构和晶体纯度的影响。

1.4 L-Arg发酵液制备AAKG的工艺研究

以实验室筛选获得的精氨酸高产突变株C.crenatum SYPH5－8为菌种进行L-Arg发酵，采用5L自动控制发酵罐。发酵培养基配方如下:

葡萄糖150，玉米浆 40，(NH4)2SO420，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，121℃灭菌20 min，流加氨水控制 pH 7.0～7.2。

发酵液预处理［5］:先加入过量草酸沉淀Ca2+，在60℃下加热10 min沉淀蛋白质后，在pH 10.0，30℃下用聚丙烯酰胺(400 mg/L)对发酵液进行絮凝，离心去除菌体等固形物后，再加入活性炭(10 g/L)，调节pH5.0，加热至80℃进行脱色处理30 min，最后经过滤或离心得L-Arg清液。

结晶操作:将预处理后的L-Arg发酵液减压浓缩至1 mol/L，加入α-KG固体粉末，反应充分后，进一步浓缩至1.5～3.0 mol/L，调节溶液pH 3.0～4.0，然后将浓缩液进行缓慢降温结晶。考察结晶的AAKG的产率，纯度及晶体组成比。

1.5 AAKG晶体纯度及组成比分析

AAKG在水溶液中解离为L-Arg及α-KG，采用HPLC同时测定溶液中 L-Arg和 α-KG的含量。HPLC为Dionex UltiMate 3000液相色谱仪，色谱柱Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm)，流动相采用甲醇/水/H3PO4(5/95/0.05)，进样体积 10 μL，流速 0.8 mL/min，柱温30℃。采用紫外检测器，检测波长210 nm。

测试样品AAKG晶体先在60～80℃下真空干燥8 h，称取并配置成4 g/L溶液。样品的HPLC色谱峰保留时间应与L-Arg、α-KG标准品一致。根据标准品溶液浓度和峰面积分别计算AAKG中L-Arg、α-KG的含量。AAKG晶体纯度为晶体中L-Arg、α-KG的总含量与晶体质量的百分比，晶体组成比为L-Arg与α-KG的摩尔比。结晶操作中的AAKG晶体收率是指制备出的AAKG质量与反应液中L-Arg、α-KG的总含量的百分比。

1.6 AAKG的质量指标研究

AAKG纯度、晶体组成比按上述方法进行测定。水分按《食品安全国家标准——食品中水分的测定》(GB5009.3－2010)中直接干燥法进行测定;灰分按《食品安全国家标准——食品中灰分的测定》(GB5009.4－2010)一般食品的测定方法进行测定;pH测定为0.1g样品溶解在20 mL蒸馏水中的溶液pH，用pH计测量;比旋光度按《化学试剂-比旋光本领(比旋光度)测定》(GBT 613－2007)中通用方法测定，测定仪器选用WZZ-2B自动旋光仪，样品浓度为0.16g/mL(H2O)，旋光管长度10 cm，温度20℃，钠光谱D线589.44波长。

菌落总数按《食品微生物学检验菌落总数测定》(GB 4789.2－2010)进行检验;大肠杆菌数按《食品卫生微生物学检验 大肠杆菌计数》(GB/T 4789.38－2008)中“大肠杆菌MPN计数”进行试验;采用石墨炉原子吸收法及原子荧光光谱法对AAKG样品中铅，砷，汞重金属含量进行测定。

2 结果与讨论

2.1 AAKG结晶工艺研究

L-Arg和α-KG均可溶于水中，但体系的不同pH值影响到二者的解离。L-Arg分子中基团α-COOH的 pK1为2.17，α-NH+3的pK2为9.04，侧链胍基上H的pK3为12.84。其PI主要决定于pK2和pK3，PI=(pK2+pK3)=10.94。因此，在小于pI的pH体系下，L-Arg主要是以α-NH+3形式存在。同样，α-KG是有机二元酸，也存在二级解离情况。实验通过滴定法测定其pK1=1.88，pK2=2.35，显然这2个解离常数相差较小，羧酸结合阳离子能力较强，因此在与LArg成盐时，单精氨酸盐与双精氨酸盐均容易形成，但是否能够从溶液中析出特定的晶体，还需要取决于他们的溶解度。

图1 L-精氨酸的解离情况

pH是影响溶解度的主要因素之一，而溶液体系的pH与L-Arg和α-KG的含量和组成比例直接有关。在自然pH体系下，随着二者摩尔分率的改变，体系pH也不断变化，图2显示的是在1 mol/L L-Arg溶液中，不断加入α-KG后，体系pH从10逐渐降低到2.3左右。初步结晶实验也表明，当体系pH为3～4时，L-Arg与 α-KG较易形成 MAAKG晶体，而DAAKG晶体形成区域主要在pH 2.5～3.5，在上述范围之外，很难通过结晶获得AAKG晶体。要获得特定组成的AAKG晶体，可以通过控制溶液体系中溶质的摩尔分率达到调控体系pH的目的。实验以制备MAAKG为目的，具体考察了混溶比例，溶液浓度，结晶温度及降温速率对晶体收率和晶体纯度的影响。

图2 不同比例L-Arg与α-KG反应，溶液pH变化情况

2.1.1 L-Arg和α-KG的混溶比例对晶体组成比影响

参照1.3.1的基本步骤，在50 mL的溶液中，考察α-KG∶L-Arg的摩尔比在0.8～1.6范围内AAKG晶体形成情况，表1数据显示，从不同比例L-Arg和α-KG反应，结晶制备出的AAKG的产率、纯度及晶体组成比有较大的差异。当反应物中L-Arg和α-KG为1∶1定量添加的时候，制备出的AAKG产率和纯度均较高，产率达到71.5%，纯度达到92.7%，且晶体中L-Arg和α-KG的摩尔比与其他组比最接近1∶1，这是制备AAKG的优化条件。

表1 L-Arg与α-KG反应比例对AAKG结晶产率和纯度的影响

2.1.2 溶液浓度对AAKG制备的影响

溶液的起晶浓度影响晶体的收率，也将对生产的能耗产生较大影响。实验通过控制不同的浓缩比，考察不同的起晶浓度对晶体产率、纯度及晶体组成摩尔比的影响(表2)。随着起晶浓度的提高，AAKG的产率也不断提高，但当溶液浓度超过2.50 mol/L时，进一步浓缩将变得十分困难，而且将使杂质浓度提高，降低晶体的纯度。由于溶液浓缩是一个十分耗能的过程，在保证一定收率的基础上，尽量降低蒸发量可以大幅度节能，因而从工业经济角度出发，适宜的起晶浓度为1.5 mol/L。更为优化的方案应该结合溶液的杂质含量、产品纯度要求以及后续的冷却过程等多方面因素得出。

表2 不同起晶浓度对AAKG结晶产率和纯度的影响

2.1.3 结晶温度和降温速率对AAKG制备的影响

冷却结晶是通过降温使溶液成为过饱和溶液而析出结晶，这是常用的结晶方法之一，尤其适合溶解度随温度降低而显著下降的物质。由于缺少AAKG的溶解度等相关数据，不能通过理论的推导确定冷却结晶的控制参数。故实验研究了5℃、10℃、15℃下的AAKG结晶情况，并分别比较了快速降温(10℃/h)和缓慢降温(2℃/h)两种方式对晶体收率、纯度和晶体组成比的影响(表3)。

表3 结晶温度和降温速率对AAKG结晶产率和纯度的影响

数据表明，低温下的缓慢均匀的降温结晶，可以获得纯度较高的AAKG晶体，而晶体产率、组成摩尔比没有较大差异。在缓慢降温结晶中，可以获得颗粒较大的晶体颗粒，晶体的比表面积小，晶体表面对母液和杂质的吸附也减少，因而可以增加产品纯度。相比而言，快速降温所形成的晶形较小，而且快速结晶过程中，容易形成母液的晶间包藏，使晶体纯度下降。同样，溶液的冷却，尤其是10℃以下的冷却也是一个耗能过程，在满足工艺目标的前提下，为降低能耗应优先选择较高的结晶温度，显然在10℃进行控温结晶既具有良好的过程经济性，也可以获得较为理想的收率和晶体纯度。

2.2 L-Arg发酵液结晶制备AAKG的工艺研究

发酵法制备L-精氨酸是发展趋势，与水解法相比其产品具有良好的安全性，但目前L-精氨酸发酵仍存在产酸率低、发酵周期长等问题。谷氨酸棒杆菌(C.crenatum)SYPH5－8是1株高产精氨酸的突变株，产酸水平在40 g/L左右，其发酵液中除了L-精氨酸外，还含有较多的Ca2+，残余培养基成分及大量菌体，此外，还含有少量的谷氨酸、赖氨酸等副产物，在进行结晶操作前，需要通过相对简捷的预处理工艺尽可能去除这些杂质。实验采用草酸沉淀Ca2+及60℃下加热10 min沉淀蛋白质，用聚丙烯酰胺促进菌体等固型物絮凝，用活性炭吸附发酵液中色素及少量杂氨酸。

由于发酵液的L-Arg含量较低，需要进行浓缩。3.0 L发酵液浓缩至600 mL，离心去除溶液中少量的沉淀，测定浓缩液中L-Arg浓度为1.1 mol/L。参照AAKG的结晶工艺条件，按照等摩尔比例加入α-KG，待充分溶解后，进一步浓缩至体积400 mL左右，达到起晶浓度，其L-Arg浓度约为1.68 mol/L。采用缓慢降温方式使溶液冷却至室温，再置入8～10℃恒温箱中育晶24 h。回收晶体，并采用乙醇进行晶体洗涤，干燥后进行含量及组成测定(结果见表4)。再取制备出的AAKG粗晶体50 g溶解在100 mL去离子水中，加热充分搅拌后过滤。将滤液以上述同样的条件进行重结晶和乙醇洗涤，干燥后进行含量及组成测定(结果见表4)。

表4 L-Arg发酵液制备的AAKG的产率，纯度及L-Arg∶α-KG 的测定

由于母液中含有较多的杂质，AAKG晶体纯度较低，需要采用重结晶方式提高晶体纯度。但重结晶操作影响AAKG收率，母液中含有较多的产品成分，在工业大生产中需要考虑回收与利用。综合上述研究内容，本文初步提出由L-精氨酸发酵液制备AAKG晶体的工艺流程(图3)。图中所示的预处理包含上文提到的絮凝、活性炭吸附以及菌体分离等过程;浓缩操作可以采用减压浓缩，也可以选择反渗透等膜法浓缩，母液可以采用离子交换树脂选择性吸附，冷却结晶可以选择真空连续蒸发结晶器来提高结晶效率和晶体收率。

图3 L-Arg发酵液进行AAKG结晶流程示意图

2.3 AAKG质量指标研究

对L-Arg发酵液制备出的4个批次的结晶型AAKG进行理化指标、卫生指标测定，结果见表5。相关指标符合我国食品卫生质量要求，而且指标具有良好的稳定性，因此，采用结晶法进行AAKG制备，其质量可控性较高。需要采用絮凝、吸附等方法进行预处理，2是采用乙醇对晶体进行洗涤，3是利用重结晶方法可以有效提高产品纯度。

表5 AAKG的质量指标测定

本文提出从L-Arg发酵液直接制备AAKG，旨在绕开L-精氨酸的提取过程，而该过程不仅使用大量的酸碱化学品，而且涉及大规模的树脂吸附、洗脱和L-精氨酸的结晶、干燥，能耗物耗高，流程长并与AAKG制备过程部分重复，因此将L-Arg发酵生产与AAKG的制备进行耦联，能够有效缩短流程，减少排放，节省制备成本。更为重要的是，该生产路线能够保证产品的安全性和质量稳定性。但必须指出的是，对发酵液进行浓缩，也是一个高能耗的过程，为进一步降低能耗，可以采用反渗透或纳滤方法进行膜法浓缩，也可以通过超滤等方式脱除溶液体系的大分子杂质，这对提高过程效率和产品收率有显著意义，将是下一步放大试验的重要研发内容之一。

3 结果与讨论

本文对影响AAKG结晶工艺的溶液pH、L-Arg与α-KG的投料比、起晶浓度以及冷却方式进行了初步探索，在此基础上开展了L-Arg发酵液直接进行AAKG的结晶实验，获得了纯度高、品质稳定的结晶。研究认为，AAKG结晶操作的关键控制参数是溶液的pH，在pH 3～4较易形成MAAKG晶体，而L-Arg与α-KG适宜的投料比是1∶1;本研究还从减少能耗和提高工业经济性角度，提出适宜的起晶浓度为1.5 mol/L，适宜的结晶温度是10℃左右，而缓慢的降温操作有利于提高晶体纯度。以L-Arg发酵液为原料进行AAKG结晶，为提高晶体纯度和结晶效率，1是

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