大孔吸附树脂分离纯化核桃壳总黄酮*

宋倩，赵声兰，刘芳，陈朝银，吕昌勇，刘彬球

1(昆明理工大学，云南昆明，650500) 2(云南中医学院，云南昆明，650200)

核桃(Juglans regin Linn.)属胡桃科，主要分布于亚、欧、美等大洲。核桃在我国栽培历史悠久，资源丰富，面积、产量世界第一［1-2］，随之而产生的核桃副产物也相当的可观。国内外研究表明，胡桃青皮黄酮以及楸皮黄酮具有抗氧化、抗菌、降血压、抗肿瘤等生物活性［3-4］。核桃副产物中的核桃壳除了含有大量的碳水化合物和粗纤维外，还含有黄酮类化合物，但是目前核桃壳主要作燃料用，造成资源的浪费，其资源的开发利用尚存在很大潜力。大孔吸附树脂性质稳定，吸附量大，具有较好的选择性，再生处理方便［5-6］，广泛用于中草药中生物活性物质的分离纯化，尤其适用于黄酮类化学物的分离纯化［7］。本实验通过比较 5种大孔吸附树脂［8-10］(NKA-9、AB-8、X-5、HPD-100和D101)对核桃壳总黄酮的吸附解吸性能，筛选出较适合纯化核桃壳总黄酮的树脂，并对其动态吸附特性进行了研究，确定优化工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料

核桃壳，采于云南省昭通市，干燥后粉碎成粉，过60目筛;芦丁标准品，上海同田生物技术股份有限公司;大孔吸附树脂，河北沧州宝恩吸附材料科技有限公司，5种大孔树脂的物理性能见表1。

1.2 仪器

旋转蒸发仪，郑州长城科工贸有限公司;紫外可见分光光度计，Amersham Biosciences;电子分析天平，上海菁海仪器有限公司;冷冻干燥机，郑州长城科工贸有限公司;BSZ-100自动部分收集器，上海泸西分析仪器厂;HLD-2恒流泵，上海泸西分析仪器厂。

表1 大孔吸附树脂物理性能

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线和回归方程的建立

本实验采用 NaNO2-Al(NO3)3比色法［11］测定芦丁标准曲线。称取10mg芦丁标准品于50 mL容量瓶，60%乙醇定容，得芦丁标准液质量浓度为0.20 mg/mL。吸取芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL质量分数5%的NaNO2溶液，反应6 min，再加入0.3mL质量分数10%的Al(NO3)3溶液络合6 min，加入4 mL 4%的NaOH，最后用30%乙醇定容，摇匀，显色15 min，测定510 nm处吸光值，得到芦丁溶液浓度c(mg/mL)与吸光度A的回归方程为:A=12.395c+0.0027，R2=0.999 9。

图1 芦丁标准曲线

1.3.2 核桃壳总黄酮供试液制备

取粉碎好的核桃壳，干燥后过60目筛备用。提取条件:提取液为体积分数60%乙醇，料液比1∶30(g∶mL)、温度80℃、回流2 次(1.5 h/次)，合并滤液，按照1.3.1方法测定滤液中黄酮含量，减压旋转蒸发浓缩，冻干制成核桃壳黄酮粗提物备用。

供试液:取核桃壳黄酮粗提物4 g，溶于1 000 mL蒸馏水中，按照1.3.1的方法测定供试液中总黄酮的浓度为c0。供试液浓度为4 mg/mL，在实验过程中按要求进行稀释。

1.3.3 大孔树脂预处理

大孔吸附树脂浸泡在体积分数95%的乙醇中，充分溶胀，湿法装柱，用95%乙醇清洗至流出液加适量蒸馏水无混浊，再用蒸馏水洗至流出液无醇味。质量分数5%HCl溶液酸洗，蒸馏水洗至中性，质量分数5%NaOH溶液碱洗，蒸馏水洗至中性，树脂备用。

1.3.4 静态吸附实验

1.3.4.1 静态吸附和解吸实验

称取预处理后的5种树脂各5 g(滤纸吸干)分别装入100 mL的锥形瓶中，加入4 mg/mL的核桃壳供试液20 mL，室温下振荡吸附12 h，分别吸取上清液2 mL，按1.3.1方法测定吸光值为c1。将吸附饱和的树脂抽滤后，蒸馏水洗涤一次，移入100 mL的锥形瓶，加入70%乙醇50 mL，振荡解吸6 h，吸取上清液2 mL，测定吸光值为c2。

其中:c0为起始浓度(mg/mL);c1为平衡浓度(mg/mL);c2为解吸液浓度(mg/mL)，V为吸附液体积(mL)，m为树脂质量(g)。

1.3.4.2 静态吸附动力学特性的测定

综合考虑各树脂的吸附率和解吸率，选择最适合的树脂测定其静态吸附动力学曲线。准确称取大孔树脂5 g(滤纸吸干)装入锥形瓶中，加入4 mg/mL的核桃壳供试液20 mL，恒温振荡，在7 h内每小时取上清液2 mL，测定吸光值，绘制静态吸附动力学曲线。

1.3.4.3 上样液pH值的确定

准确称取静态实验所筛选树脂5 g于三角瓶中，分别加入不同pH值的核桃壳供试液20 mL，恒温振荡，达到吸附饱和后取上清液2 mL，测定吸光值。

1.3.5 动态吸附试验

将预处理好的树脂装入1.2 cm×20 cm的色谱柱中，装柱体积为20 mL。将核桃壳供试液调整到最适pH值上柱，对上样浓度、流速、洗脱液浓度等进行动态吸附与解吸实验。实验中待样液全部通过树脂柱后，用去离子水洗至流出液无色，再用不同浓度的乙醇以一定速度洗脱，收集洗脱液，测定总黄酮含量。

1.3.6 核桃壳黄酮回收率和纯度的测定

将核桃壳供试液按最佳工艺上柱洗脱，收集洗脱液，检测黄酮浓度，减压旋转浓缩后冻干，计算核桃壳黄酮的回收率和纯度。

其中:c0为上样浓度(mg/mL)，c3为洗脱液中黄酮浓度(mg/mL)，V0为上样体积(mL)，V3为洗脱液体积(mL)，G为洗脱液冻干后质量(mg)。

1.3.7 数据分析

实验数据用OriginPro7.5统计软件进行分析统计。

2 结果与讨论

2.1 核桃壳总黄酮含量以及供试液黄酮浓度

按照上述提取方法得核桃壳粗提物的提取率为10.68%，核桃壳中总黄酮含量为3.38 mg/g，供试液浓度为4 mg/mL时，供试液中黄酮的浓度为0.143 mg/mL，经计算粗提物中黄酮纯度为3.58%。

表2 核桃壳中总黄酮含量

表3 供试液总黄酮浓度

2.2 不同大孔树脂的吸附率和解吸率

由表4可以看出，极性树脂和弱极性树脂对于核桃壳总黄酮吸附能力较强，非极性树脂的吸附能力相对较差，可能核桃壳黄酮具有一些多酚结构或糖苷键结构，有一定的极性和亲水性，比较容易吸附于弱极性和极性树脂上。AB-8和NKA-9吸附率比较高，解吸效果也比非极性树脂好，说明核桃壳黄酮与非极性树脂结合的比较紧密，较难洗脱;虽然AB-8的解吸率最好，可是从吸附率和解吸率综合考虑，NKA-9是较适合于核桃壳黄酮的分离纯化的大孔吸附树脂。

表4 不同树脂对核桃壳总黄酮的吸附率与解吸率

2.3 NKA-9树脂静态吸附动力学特征

由吸附率和解吸率选择较为合适的NKA-9树脂进行静态吸附动力学实验，其静态吸附动力学曲线如图2所示。

图2 NKA-9静态吸附核桃壳黄酮动力学曲线

由图2可以看出，吸附时间3h后NKA-9树脂的吸附量随时间的增加变化很小，即树脂已基本达到吸附饱和平衡。在较短的时间达到吸附平衡，说明这种树脂对核桃壳黄酮的吸附属于快速平衡型，快速吸附意味着可以缩短生产周期，这在工业上是很有利的。

2.4 上样液pH值的影响

由图3可以看出，随着pH值的降低吸附量逐渐升高，说明一定的酸性条件有利于核桃壳黄酮的吸附，其原因可能是黄酮类化合物含有酚羟基和糖苷键，当pH值较小时以分子状态存在，主要依靠范德华力与树脂进行物理吸附;而在碱性条件下，以离子状态存在，吸附比较困难［12］。但是实验过程中发现，pH值为3和4时在吸附过程中有絮状沉淀产生，极易吸附在树脂上，在上柱过程中就会容易阻塞树脂柱，反而影响黄酮的吸附，综合考虑选择pH值为5作为上样液的最适pH值。

2.5 NKA-9树脂对核桃壳黄酮的动态吸附实验

2.5.1 上样浓度对核桃壳总黄酮吸附的影响

图3 pH值对吸附特性的影响

流速1.0 mL/min，pH 5.0，上样液黄酮质量浓度分别为 0.5、1.0、2.0、3.0 mg/mL，每 10 mL 收集流出液测定渗透液中核桃壳总黄酮的质量浓度，绘制动态动力学曲线，如图4所示。

图4 不同上样浓度的动态吸附曲线

由图4可以看出，核桃壳总黄酮质量浓度为0.5 mg/mL和1.0 mg/mL时，吸附动态动力学曲线比较靠近，随着上样体积的增加，在一定范围内渗透液中黄酮的质量浓度变化不大，且含量比较低，泄漏不严重;但是上样质量浓度增加会使传质速度变慢，导致树脂周围的黄酮分子过多，使得部分黄酮没来得及被吸附就流出来，使泄漏提前，最终导致树脂的吸附量降低。所以上样质量浓度确定为1.0 mg/mL。

2.5.2 上样流速对核桃壳总黄酮吸附的影响

上样质量浓度为1.0 mg/mL，pH值5.0，分别控制流速为0.5、1.0、2.0、3.0 mL/min，每 10 mL 收集流出液，测定渗透液中总黄酮的质量浓度，绘制动态动力学曲线。如图5所示。

图5 不同上样流速的动态吸附曲线

由图5可以看出，0.5和1.0 mL/min的动态吸附曲线比较接近，而2.0和3.0 mL/min略高于0.5和1.0 mL/min;可能是流速较慢时总黄酮与树脂接触的时间较长，有利于扩散到树脂内部，减少了泄漏量，提高了吸附率。但是上样流速过慢，操作时间长，综合考虑吸附率和效率，最终选择上样流速为1.0 mL/min。

2.5.3 洗脱液体积分数对核桃壳总黄酮吸附的影响

上样质量浓度为1.0 mg/mL，pH值5.0，上样流速为1.0 mL/min，上样量为10BV，上样结束后用3BV体积的蒸馏水洗涤，然后分别用体积分数50%、60%、70%、95%乙醇溶液洗脱，每5mL收集洗脱液，测定洗脱液中总黄酮的质量浓度，绘制动态动力学曲线。如图6所示。

图6 不同洗脱体积的解吸动力学曲线

由图6可看出，随着乙醇体积分数的升高，解吸效果越来越好。70%和95%乙醇的洗脱效果都比较好，解吸曲线尖锐，洗脱峰集中并且非常对称，没有明显的拖尾迹象。但是相比较而言95%的解吸率更高，解吸完全。

2.5.4 核桃壳总黄酮回收率和纯度

经计算吸附前核桃壳粗提物中总黄酮纯度为3.58%，NKA-9树脂纯化后测定纯度为62.3%，总黄酮的纯度大大提高，回收率为88.9%。如表5所示。

表5 核桃壳总黄酮回收率及纯度

3 结论

通过对5种大孔树脂的静态吸附与解吸研究，发现NKA-9型大孔树脂效果比较理想，吸附率大、解吸率高，比较适合核桃壳总黄酮的分离纯化。NKA-9树脂对核桃壳总黄酮最佳上样工艺参数为:上液样pH值为5.0，上样液质量浓度为1 mg/mL，上样流速为1 mL/min，吸附率相对较高，纯化周期短。用95%的乙醇洗脱核桃壳黄酮，洗脱峰集中，对称性好，无明显的拖尾现象，5BV的95%乙醇基本上能将核桃壳总黄酮全部洗脱下来。吸附前核桃壳粗提物中总黄酮纯度为3.58%，经NKA-9树脂纯化后测定纯度为62.3%，总黄酮的纯度大大提高，回收率为88.9%。

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