大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞的生物学特性＊

吴 斌， 吴永超， 潘海涛， 郭晓东， 郑启新

华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，武汉 430022

轴突脱髓鞘在脊髓损伤、多发性硬化和脊髓侧索硬化等多种神经系统疾病的病理改变中都占有重要地位，脱髓鞘的轴突失去了正常的神经传导功能，导致机体出现感觉运动功能障碍，因此促进髓鞘再生是多种脊髓疾病的治疗目标。轴突脱髓鞘是因各种损伤因素导致少突胶质细胞的凋亡、坏死引起的，当轴突脱髓鞘后，脱髓鞘病变周围的少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）增殖并迁移至脱髓鞘区域，分化为少突胶质细胞包裹轴突形成新的髓鞘，这一过程称为髓鞘再生。有研究表明，中枢神经系统不同区域的OPCs具有不同的生物学特性［1］，而且OPCs并不能远距离地迁移，脊髓的脱髓鞘病变，只能由位于脊髓的OPCs完成髓鞘再生［2］。因此建立脊髓源性OPCs体外培养模型，并阐明其生物学特性对研究脊髓脱髓鞘疾病的发病机制及促进髓鞘再生具有重要意义。本研究采用免疫吸附法原代培养大鼠脊髓源性OPCs，并在体外观察其增殖及分化等生物学特性，以期为使用各种干预手段促进OPCs更好地完成髓鞘再生奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

出生1～3d的Sprague－Dawley大鼠（同济医学院实验动物学部提供），雌雄不限，谷氨酰胺（Gib－co公司），DMEM／F12 培养液及胎牛血清（Hyclone公司），N2 添加剂及B27 添加剂（Invitrogen公司），血小板源性生长因子（platelet－derived growth factor，PDGF－aa）及碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）（晶美公司），Hoechst33342（Hyclone公司），胰酶及多聚赖氨酸（Sigma 公司），髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）抗体及半乳糖脑苷脂（actocerebroside，GalC）抗体（Abcam 公司），RAN－2 抗体、NG2抗体及A2B5 抗体（Invitrogen 公司），荧光标记二抗（武汉博士德公司）。

1.2 大鼠脊髓源性OPCs的分离培养

将新生大鼠断颈处死后，75%乙醇浸泡消毒3 min，取出延髓以下脊髓组织，剥除脑脊膜及血管，将取出的脊髓切为1mm3的组织块，浸入D－Hank液中，加入0.1%的胰蛋白酶，充分吹打混匀后置于37℃恒温水浴中消化30min，之后加入等体积的含20%胎牛血清的DMEM／F12培养液终止消化。将细胞悬液用70μm 的筛网过滤、离心及重悬后，接种至包被了RAN－2抗体的培养皿中以去除星形胶质细胞及脑脊膜细胞，30 min 后收集未贴壁的细胞，接种至包被了A2B5抗体的培养皿中以获得纯化的OPCs，1h 后用0.25%的胰酶消化贴壁的细胞，漂洗、离心、重悬后接种至放有包被了多聚赖氨酸玻片的6孔板中，用无血清培养液（DMEM／F12含1%N2，1%B27，20 ng／mL bFGF，10 ng／mL PDGF－aa）进行培养，每2天更换1／3培养液。

1.3 大鼠脊髓源性OPCs的鉴定

免疫吸附纯化的OPCs经过24h的培养后，进行免疫荧光染色观察其特异性标志物A2B5 及NG2的表达情况，并计算其阳性率。具体方法如下：4%多聚甲醛固定细胞玻片，PBS 冲洗后，加入10%羊血清37℃孵育30min，加入A2B5（1∶200）及NG2（1∶200）抗体，4℃过夜；PBS漂洗后分别加入相应的荧光标记的二抗（1∶500），37℃孵育30 min，PBS漂洗后加入Hoechst33342（1∶500）37℃避光孵育5min，甘油封片。空白对照用PBS代替一抗。随机取5个视野，计算每个视野中NG2阳性细胞所占Hoechst33342染色细胞的百分比。

1.4 大鼠脊髓源性OPCs增殖能力的检测

采用Alarm blue法检测OPCs的增殖能力，绘制生长曲线。选择生长良好的第2代的OPCs制成细胞悬液，将细胞密度调整为1×104／mL，以每孔200μL细胞悬液接种于96孔板，分7组，每组5个复孔。连续培养7d，每天取1组细胞，每孔加入20 μL Alarm blue原液，在细胞培养箱中孵育2h后用酶联免疫检测仪检测各孔A 值（吸收波长570nm）。

1.5 大鼠脊髓源性OPCs的诱导分化

将培养3d，生长良好的OPCs进行诱导分化培养。撤去原来的普通培养液，加入诱导培养液（主要成分为DMEM／F12，1%NS，1%B27，30 ng／mL T3），在5%CO2，饱和湿度，37℃条件下培养，每3天更换新鲜诱导培养液，诱导培养6d后行MBP及GalC免疫荧光染色，具体步骤同1.3项。

2 结果

2.1 原代培养的大鼠脊髓源性OPCs的生长情况

本研究采用免疫吸附法对大鼠脊髓组织中的OPCs进行纯化，新生大鼠脊髓组织经消化、过滤后获得了混杂细胞悬液，镜下观察悬液中的大部分细胞呈球形、悬浮状，将该细胞悬液依次经过包被RAN－2抗体和A2B5抗体的培养皿分离纯化，所得细胞胞体呈圆形，周围折光明显，部分细胞有双极突起，接种24h后，可见大部分细胞贴壁，呈圆形或椭圆形，有双极突起的细胞增多。

2.2 大鼠脊髓源性OPCs的鉴定

将原代培养24h的细胞经固定后进行免疫荧光染色，观察OPCs的特异性标志物A2B5及NG2的表达情况，结果显示：大部分细胞呈A2B5 及NG2阳性（图1），镜下随机选取5 个视野，计算A2B5及NG2阳性细胞比例，发现两者阳性的细胞比例均达95%以上。

图1 激光共聚焦显微镜下观察大鼠脊髓源性OPCs的免疫荧光染色（×200）Fig.1 The immunofluorescence staining of OPCs derived from the spinal cord of rats under the confocal laser scanning microscopy（×200）

2.3 大鼠脊髓源性OPCs在体外的增殖能力

本研究采用Alarm blue法检测OPCs的体外增殖能力，结果如图2 所示。OPCs在体外环境的倍增时间约为4d，这说明本研究培养的大鼠脊髓源性OPCs在体外具有良好的增殖能力。

图2 大鼠脊髓源性OPCs的细胞生长曲线Fig.2 The growth curve of OPCs derived from the spinal cord of rats

2.4 大鼠脊髓源性OPCs向成熟少突胶质细胞的定向分化

加入诱导培养液24h后，部分OPCs开始出现肉眼可见的形态学变化，表现为胞体略增大，突起增多，随着诱导时间的延长，发生形态变化的细胞逐渐增多，至诱导6d后大量细胞表现为成熟少突胶质细胞样形态，免疫荧光染色显示，这些细胞呈MBP及GalC阳性（图3），说明这些细胞为成熟的少突胶质细胞。

图3 激光共聚焦显微镜下观察大鼠脊髓源性OPCs的分化潜能（×200）Fig.3 The multiple differentiation potential of OPCs derived from the spinal cord of rats under the confocal laser scanning microscopy（×200）

3 讨论

少突胶质前体细胞来自于胚胎发育早期神经管腹侧神经上皮细胞，随着神经管的发育，OPCs逐步增殖、迁移并分化为成熟少突胶质细胞，形成中枢神经系统轴突的髓鞘［3］。OPCs作为一种成体干细胞广泛分布于成年动物中枢神经系统，当缺血、缺氧、创伤、感染及自身免疫反应等各种损伤因素使少突胶质细胞凋亡、坏死从而导致脱髓鞘病变时，OPCs开始增殖并迁移至脱髓鞘区域，分化为少突胶质细胞包裹脱髓鞘轴突形成新的髓鞘。目前认为，OPCs并非一种均质、单一的细胞类型，而且源自中枢神经系统不同区域的OPCs具有不同的生物学特性，例如来自海马的OPCs表达成熟星形胶质细胞标志物S100，而来自大脑皮层的OPCs 并不表达S100［4］。还有研究表明发生脱髓鞘病变后，只能招募脱髓鞘病变周围2mm 范围内的OPCs进行髓鞘再生［5］，因此脊髓的脱髓鞘病变，只能由位于脊髓的OPCs完成髓鞘再生。综上所述，建立OPCs体外培养模型，并阐明其生物学特性对促进脊髓脱髓鞘疾病的髓鞘再生具有重要意义。

原代培养OPCs首先需要对OPCs进行分离纯化，目前常用的分离纯化方法有两类：一类是利用不同细胞粘附性的差异纯化OPCs，如差速振荡法［6］；另一类是利用不同细胞表面标志物的差异，通过免疫吸附纯化OPCs，包括免疫磁珠法［7］、流式细胞仪分选法［8］以及培养皿免疫吸附法［9］。差速振荡法操作简便，但获得的OPCs纯度较低；免疫磁珠法和流式细胞仪分选法所获得的OPCs纯度较高，但其成本较高，而且操作复杂，应用不是很广泛；培养皿免疫吸附法操作相对简单，而且可以获得较高纯度的OPCs，因此本研究采用培养皿免疫吸附法从新生大鼠脊髓组织中分离纯化OPCs。脊髓组织中存在多种类型的细胞，其中对OPCs原代培养影响最大的是星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和脑脊膜细胞。RAN－2是星形胶质细胞、室管膜细胞和脑脊膜细胞的特异性表面标志物，因此本研究首先利用包被了RAN－2抗体的培养皿去除星形胶质细胞及脑脊膜细胞，还有些研究者主张再用成熟少突胶质细胞特异性标志物GalC 包被的培养皿去除少突胶质细胞［10］，然而我们在预实验中发现这一步骤会使OPCs大量损失，因此本研究没有采用这一步骤，而是直接用包被了A2B5 抗体的培养皿富集纯化OPCs。后续的免疫荧光染色鉴定结果显示本研究获得的OPCs纯度在95%以上，这表明本研究采用的免疫吸附法是纯化OPCs简便、高效的方法。

在体外条件下维持OPCs的增殖能力，需要采用无血清培养液并添加生长因子，目前已经发现bFGF、PDGF－aa、IGF、NGF 等生长因子能够促进OPCs增殖。本研究在培养液中添加了bFGF 和PDGF－aa，同时使用了B27和N2营养成分，结果显示该培养液能够使OPCs保持未分化状态，并且增殖良好。本研究采用Alarm blue法检测了原代培养的脊髓源性OPCs的增殖能力，实验结果显示脊髓源性OPCs在体外培养条件下能够继续增殖，其倍增时间约为4d。OPCs作为一种成体干细胞，具有多向分化潜能，在特定条件下可分化为少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元。本研究对脊髓源性OPCs进行了诱导分化实验，结果显示经诱导培养24h后，部分OPCs就开始出现肉眼可见的形态学变化，随着诱导时间的延长，发生形态变化的细胞逐渐增多，诱导6d后大部分细胞呈MBP 及GalC 阳性，这说明脊髓源性OPCs在体外培养条件下仍然具备良好的分化为少突胶质细胞的潜能。

综上所述，本研究采用免疫吸附法成功建立了大鼠脊髓源性OPCs的体外培养模型，并通过体外实验观察其增殖及分化等生物学特性，实验结果表明本研究培养的脊髓源性OPCs在体外条件下具有良好的增殖能力及分化为成熟少突胶质细胞的能力，为进一步研究脊髓源性OPCs如何参与脊髓脱髓鞘疾病的病理过程奠定了基础。

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