ERK1／2通路与舌鳞癌细胞Cal－27生物学行为的相关性

李 伟， 邵乐南， 张小燕， 廖琳迪， 肖玉霞

华中科技大学同济医学院附属同济医院口腔颌面外科，武汉 430030

口腔癌是一种与环境因素密切相关的疾病，烟草和酒精是已知的重要的致病因素。在口腔恶性肿瘤中，90%以上都是鳞状细胞癌，占所有恶性肿瘤2%～3%［1］。舌鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma of the tongue，TSCC）是最常见的口腔鳞状细胞癌，它生长快、浸润性强，早期即可发生颈淋巴结转移，且转移率很高，是导致患者死亡的重要原因。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）能够通过一系列的细胞表面受体将细胞外信号传递至细胞核，从而发挥各种调节功能，包括细胞的分裂、增殖、生长、分化、运动和细胞死亡。MAPK 家族主要包括ERKs、p38－MAPK和JNK／SAPK，还有一些其它的MAPK 成员如ERK5和ERK7等［2］。大量研究发现Ras－Raf－MEKERK信号通路在许多人类恶性肿瘤中异常激活，参与了肿瘤的发生发展。Ras是ERKs通路的上游蛋白，包括4个亚型Ha－Ras、N－Ras、Ki－Ras 4A 和Ki－Ras 4B，在人类大约20%的肿瘤中可以发现Ras的基因突变［3］。Raf是癌基因表达产物，包括A－Raf，B－Raf和Raf－1，其中B－Raf突变最为常见，在人类7%的癌变中可以检测到B－Raf基因突变，特别是在恶性黑色素瘤，甲状腺癌及结肠癌中尤为突出［4］。Ras及Raf功能突变都可以导致ERKs通路的异常激活，从而促使癌症的发生。因此这条通路作为癌症治疗的靶点被广泛研究。本实验以人舌鳞癌细胞Cal－27为研究对象，通过应用不同浓度的特异性ERK1／2信号通路抑制剂U0126进行干预后，观察肿瘤细胞一系列生物学行为的变化，分析Ras－Raf－MEK－ERK 通路在舌鳞状细胞癌发生发展以及侵袭和转移中的可能作用机制，探讨MAPK 信号通路抑制剂在肿瘤治疗中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

U0126（美国Cell Signaling 公司）；胎牛血清（HyClone公司）；胰蛋白酶（杭州四季青有限公司）；Annexin Ⅴ－FITC 试剂盒（上海贝博生物试剂公司）；二甲基亚砜（武汉科瑞科技有限公司）；MTT试剂盒（武汉鼎国生物技术有限公司）。

1.2 细胞培养

人舌鳞癌细胞系Cal－27（同济医院妇产科实验室提供）常规培养于含10%FBS 的DMEM 完全培养液中，含青霉素、链霉素（各1 U／mL），放置在37℃、5%CO2、相对湿度90%的培养箱中培养，细胞贴壁生长。0.25% 的胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，传代培养用于后续试验。

1.3 MTT法检测细胞增殖

取对数生长期Cal－27细胞，常规消化成2.5×104／mL的单细胞悬液，接种于96 孔细胞培养板，每孔200μL（边缘孔用无菌PBS填充）。37℃、5%CO2培养箱培养，待其融合到60%～70%后加药。实验分为空白调零组（即不加细胞悬液只含培养液）、阴性对照组（即加入细胞悬液和培养液）和实验组（即加入细胞悬液、培养液和U0126），其中实验组U0126药物设4 个浓度梯度（5、10、20、40μmol／L），每组设3 个重复孔。置于培养箱中共同培养12、24、36、48h 后，倒置显微镜下观察。每孔加入20μL MTT（5mg／mL），4h后弃上清，加入150μL DMSO 振荡10min，使结晶物充分溶解，用酶联免疫测定仪检测490nm 波长处的吸光度（A）值。以时间为横坐标，A 值为纵坐标使用统计软件绘制细胞生长曲线。

1.4 细胞划痕实验

先用记号笔在6孔板背后，均匀地画横线，间隔大约0.5～1.0cm 一条，横穿过孔。在每孔中加入5×105个细胞，置于培养箱中培养。待细胞融合至90%以上时，丝裂霉素预处理1h，抑制细胞分裂。用无菌枪头垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能偏斜。无血清DMEM 洗细胞3 次，去除划下的细胞，加入含不同浓度U0126（5、10、20、40μmol／L）的低血清培养液。放入37℃、5%CO2培养箱培养，分别于培养0、12、24、36、48h取样拍照。

1.5 Transwell迁移试验

0.25% 的胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，终止消化后离心弃培养液，用PBS 洗1～2 遍，无血清培养液重悬，调整细胞密度至2×105／mL。小室下层加入500μL 含2.5%FBS的培养液，上层加入200μL含不同浓度U0126（5、10、20、40μmol／L）细胞悬液，对照组不加U0126。置于37℃、5%CO2培养箱培养24h，弃去孔中培养液，甲醛室温固定30min，0.5%结晶紫常温染色10 min。清水漂洗干净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞。倒置显微镜下观察迁移细胞的数量，计算趋化指数（chemotactic index，CI）CI＝实验组平均迁移细胞数／空白对照组平均迁移细胞数×100% 。

1.6 Transwell侵袭试验

用50mg／L Matrigel 1∶8 稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。吸出培养板中残余液体，每孔加入50μL 含10g／L BSA 的无血清培养液，37℃、30 min。重复1.5的实验步骤。以膜下的细胞多少来表示细胞的侵袭能力。计算侵袭指数（invasion index，II）II＝实验组平均迁移细胞数／空白对照组平均迁移细胞数×100%。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡

离心收集经0、5、10、20、40μmol／L U0126 分别作用12、24、36、48h后的Cal－27细胞，冷PBS洗涤细胞2次。400μL Annexin Ⅴ结合液悬浮细胞，细胞密度大约为1×106／mL。细胞悬浮液中加入5 μL Annexin Ⅴ－FITC 染色液，轻轻混匀后于2～8℃避光条件下孵育15min。加入10μL 碘化丙啶（PI）染色液轻轻混匀，于2～8℃避光条件下孵育5 min。1h内上机检测。

1.8 流式细胞仪检测细胞周期

收集经0、5、10、20、40μmol／L U0126作用48 h后的Cal－27细胞，PBS洗2次，加入－4℃预冷的75%乙醇，4℃固定过夜，弃乙醇，PBS洗1次，加入Rnase 100μg／mL，加PI染色剂，避光染色20min，用流式细胞仪检测细胞周期变化。

1.9 统计学方法

应用SPSS 12.0统计软件处理数据，计量数据以均数±标准差（±s）表示，均数比较采用单因素方差分析及SNK－q检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度U0126对Cal－27细胞生长的影响

结果表明5、10、20、40μmol／L U0126 均能抑制Cal－27细胞的增殖，并且随着药物剂量的增大，作用时间的延长，抑制效果呈上升趋势，即在一定范围内呈时间－剂量依赖性。不同浓度组与阴性对照组间差异有统计学意义（均P＜0.05），各浓度组间差异也有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2 不同浓度U0126对Cal－27细胞运动能力的影响

光镜下观察，与对照组相比，U0126 对Cal－27细胞的运动有一定的抑制作用，浓度越高，抑制作用越强，表现出一定的剂量依赖性。结果如图2。

2.3 不同浓度U0126对Cal－27细胞迁移能力的影响

经过5、10、20、40μmol／L U0126处理后24h后，细胞迁移通过Transwell小室膜下的数量与对照组相比明显减少，即细胞迁移能力随药物浓度升高呈下降趋势。结果如图3。

图1 U0126对Cal－27细胞增殖生长曲线的影响Fig.1 Effect of U0126on growth curve of Cal－27cells

图2 U0126对Cal－27细胞划痕愈合的影响Fig.2 Effect of U0126on scratch healing of Cal－27cells

2.4 不同浓度U0126 对Cal－27细胞侵袭能力的影响

经过5、10、20、40μmol／L U0126处理后24h后，细胞通过Matrigel胶迁移到Transwell小室膜下的数量与对照组相比明显减少，即细胞侵袭能力随药物浓度升高呈下降趋势。结果如图4。

2.5 不同浓度U0126对Cal－27细胞凋亡的影响

U0126能促进Cal－27细胞凋亡，但在48h后各实验组细胞才出现明显凋亡现象，并且随着U0126浓度的增加和作用时间的延长，细胞凋亡率逐渐增加。不同浓度组与阴性对照组间差异有统计学意义（均P＜0.05），各浓度组间差异也有统计学意义（P＜0.05）。如图5，表1。

图3 U0126作用24h对Cal－27迁移能力的影响Fig.3 Influence of U0126on migration ability of Cal－27cells

图4 U0126作用24h对Cal－27侵袭能力的影响Fig.4 Influence of U0126on invasion ability of Cal－27cells

图5 流式细胞术检测U0126作用48h对Cal－27细胞凋亡的影响Fig.5 Apoptosis of Cal－27cells treated with U0126for 48h

表1 U0126对Cal－27细胞凋亡的影响（%，±s，n＝3）Table 1 Effect of U0126on apoptosis of Cal－27cells（%，±s，n＝3）

表1 U0126对Cal－27细胞凋亡的影响（%，±s，n＝3）Table 1 Effect of U0126on apoptosis of Cal－27cells（%，±s，n＝3）

＊P＜0.05 vs.control group（0μmol／L U0126）

U0126（μmol／L）Normal wither cells Early wither cells Late wither cells Necrosis wither cells 0 86.88±1.32 7.35±0.45 3.36±0.36 2.41±0.43 5 83.59±1.23 9.18±1.51 5.25±0.45 2.65±0.42 10 73.59±1.38＊14.18±1.65＊ 9.61±0.98＊3.62±1.05 20 64.22±1.02＊18.81±1.56＊14.41±1.22＊3.56±0.52 40 54.36±1.55＊25.24±1.89＊16.85±2.11＊4.15±0.83

2.6 不同浓度U0126对Cal－27细胞周期的影响

与对照组相比，不同浓度U0126可以使肿瘤细胞周期各个时相细胞数所占比例发生变化。药物作用后S期和G2／M 期肿瘤细胞比例减少，G0／G1期肿瘤细胞比例增加，且随药物浓度的增加而增多。如表2。

表2 U0126对Cal－27细胞增殖周期的影响（%，±s，n＝3）Table 2 Influence of U0126on cycle of Cal－27cells（%，±s，n＝3）

表2 U0126对Cal－27细胞增殖周期的影响（%，±s，n＝3）Table 2 Influence of U0126on cycle of Cal－27cells（%，±s，n＝3）

＊P＜0.05 vs.control group（0μmol／L U0126）

U0126（μmol／L）G0／G1S G2／M 0 52.23±0.74 36.15±1.43 10.55±0.79 5 56.41±0.76 33.35±1.46 10.12±0.83 10 62.26±0.84＊ 29.84±1.65＊9.48±1.23 20 75.54±1.23＊ 21.53±0.78＊4.15±0.98＊40 85.75±1.91＊ 12.29±0.77＊2.88±0.51＊

3 讨论

细胞周期的紊乱，细胞的过度增殖以及凋亡减少是口腔癌形成的重要原因。细胞信号传导系统控制着细胞的生命活动，许多癌基因和抑癌基因位于细胞信号传导通路的上游和下游，它们的功能异常与细胞的癌变也有着密切的联系。

口腔癌是世界范围内第6大常见癌症［5］。大多数低分化口腔癌死亡率很高，并且常伴有局部侵袭和区域性的转移。因此探讨其侵袭、转移的机制具有重要意义。

MAPK 家族可以被多种细胞外信号激活，在细胞的增殖、分化和凋亡中起着重要作用。MAPK 可以将细胞外信号传递至细胞核，并通过转录因子控制基因的表达。哺乳类动物的MAPK 包括3个主要的亚型ERKs、JNK／SAPK 和p38－MAPK［6－7］。每一个MAPK 都有其特别的结构和功能，调节着细胞重要的生理功能［8－10］。正常情况下，MAPK 严格地维持着细胞的生理平衡。在癌细胞中，这种平衡常常由于基因的不稳定性而被打破，造成了细胞增殖和凋亡的改变，丧失其正常的生理功能。

ERK1／2信号通路是MAPK 家族中被研究得最广泛的成员，可以被各种生长因子短暂而迅速地激活，包括EGF、NGF、PDGF。这些生长因子可以与特异的细胞表面受体比如G 蛋白偶联受体和酪氨酸激酶受体［11－12］相结合。ERK1／2信号通路涉及许多与人类癌症发生相关的原癌基因以及各种因子。研究发现EGF－R 基因在恶性胶质瘤、食管癌、肺癌等恶性肿瘤中表达增强［13－15］。在口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）中，30%以上都发现Ras原癌基因的过表达和突变。同时有研究表明在OSCC中，ERK1／2的基因mRNA 与肿瘤的TNM 分期及有无淋巴结转移有关［16］。出现淋巴结转移表明肿瘤细胞迁移和侵袭能力较强，本实验结果表明加入U0126后，肿瘤细胞穿过小室的数目减少，即迁移及侵袭能力减弱，并且与药物浓度呈负相关。说明舌鳞癌细胞的迁移和运动能力与ERK1／2通路有关，并且这一能力可以被U0126减弱，但不能被完全抑制。

Ras是小分子GTP连接蛋白，是许多信号通路的上游蛋白，这些通路包括Raf／MEK／ERK，PI3K／Akt和RalEGF／Ral［17］。现已证明Ras有4 种亚型：Ha－Ras，N－Ras，Ki－Ras 4A 和Ki－Ras 4B。它们表现出高度的序列同源性以及相同的激活和失活模式。活化性Ras突变在30%人类癌症中可以被检出。Ras的过度活化可使下游通路持续激活，使细胞无限增殖，表现出恶性特征。本实验用U0126暂时阻断ERK1／2通路后，观察到细胞增殖速度明显减慢，而且我们还观察到细胞形态从多角性逐渐趋于圆形，而且贴壁能力减弱，在较高药物浓度持续作用下，大量细胞脱落，提示肿瘤细胞的增殖失控可能与ERK1／2通路的异常激活有关。

Raf丝／苏氨酸家族包括3个亚型A－Raf，B－Raf和Raf－1。研究表明B－Raf比A－Raf和Raf－1显示出更高的基础激酶活性［18－19］，是下游激酶MEK 的主要激活剂，如果B－Raf缺失，则发现ERK 磷酸化水平降低［20］。提示来自B－Raf的异常信号可直接传递至MEK，进而激活整个ERK1／2通路，促使肿瘤发生。U0126为MEK 非ATP竞争性抑制剂，可在MEK 水平直接阻断来自B－Raf的异常信号，由此可以推测U0126可能对治疗由B－Raf突变引起的疾病有帮助。

目前化疗仍然是治疗许多恶性肿瘤的重要手段，很多化疗药物都是作用于肿瘤细胞分裂周期的各个阶段，干扰其分裂，从而抑制细胞的增殖。本实验结果表明U0126可使Cal－27细胞S 期和G2／M期肿瘤细胞比例减少，G0／G1期肿瘤细胞比例增加，从而抑制其有丝分裂。

细胞凋亡即细胞程序化死亡，是由遗传物质控制的细胞正常的生命活动，而抗凋亡则是肿瘤细胞的主要特征之一。本实验结果表明用U0126 阻断ERK 1／2通路可以诱导肿瘤细胞凋亡，提示ERK1／2通路参与了肿瘤的发生。

近年来信号通路被认为是恶性肿瘤治疗的潜在药物靶点，大量小分子抑制剂被研发并用于临床试验，取得了良好的进展。索拉非尼是第一个也是唯一一个被认可并应用于临床的Raf激酶抑制剂，它对其它激酶如VEGFR－2，VEGFR－3 和PDGFR－b也有靶向抑制作用［21］。U0126及PD98059两者均为ERK1／2通路抑制剂，都为非ATP竞争性MEK抑制剂，体外研究发现，U0126和PD98059均可抑制人黑色素瘤细胞系A375的侵袭性，并同时发现MMP－9含量降低［22］。

本实验结果也表明U0126 可以抑制舌鳞癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，并能够抑制癌细胞的迁移和侵袭能力，提示U0126可能对肿瘤治疗有帮助。但是实验结果也显示U0126不能完全抑制肿瘤细胞的恶性生物学行为，说明可能有多条信号通路支配肿瘤细胞的生命活动，提示须将多条信号通路抑制剂联合使用，才能达到治疗的目的。应该注意的是，信号通路也调节着正常细胞的生命活动，若被完全阻断，势必会对正常细胞造成不利影响，可能会引起毒性反应，如何避免这一后果，还需要进一步研究。此外有动物实验证明，MAPK 通路参与了由肺损伤引起的炎症应答反应，应用U0126进行干预，可以降低IL－2 和TNF－α的释放，可以保护由脂多糖诱导的急性肺损伤［23］。这也提示MAPK 抑制剂在治疗炎性及其它疾病的应用潜力。

［1］ Kademani D.Oral cancer［J］.Mayo Clin Proc，2007，82（7）：878－887.

［2］ Kato Y，Tapping R I，Huang S，et al.Bmk1／Erk5is required for cell proliferation induced by epidermal growth factor［J］.Nature，1998，395（6703）：713－716.

［3］ Malumbres M，Barbacid M.RAS oncogenes：the first 30years［J］.Nat Rev Cancer，2003，3（6）：459－465.

［4］ Davies H，Bignell G R，Cox C，et al.Mutations of the BRAF gene in human cancer［J］.Nature，2002，417（6892）：949－954.

［5］ Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2006［J］.CA Cancer J Clin，2006，56（2）：106－130.

［6］ Han J，Lee J D，Bibbs L，et al.A MAP kinase targeted by endotoxin and hyperosmolarity in mammalian cells［J］.Science，1994，265（5173）：808－811.

［7］ Boulton T G，Nye S H，Robbins D J，et al.ERKs：a family of protein－serine／threonine kinases that are activated and tyrosine phosphorylated in response to insulin and NGF［J］.Cell，1991，65（4）：663－675.

［8］ Davis R J.The mitogen－activated protein kinase signal transduction pathway［J］.J Biol Chem，1993，268（20）：14553－14556.

［9］ Eastman A.Survival factors，intracellular signal transduction，and the activation of endonucleases in apoptosis［J］.Semin Cancer Biol，1995，6（1）：45－52.

［10］ Treisman R.Regulation of transcription by MAP kinase cascades［J］.Curr Opin Cell Biol，1996，8（2）：205－215.

［11］ van Biesen T，Luttrell L M，Hawes B E，et al.Mitogenic signaling via G protein－coupled receptors［J］.Endocr Rev，1996，17（6）：698－714.

［12］ Hill C S，Treisman R.Transcriptional regulation by extracellular signals：mechanisms and specificity［J］.Cell，1995，80（2）：199－211.

［13］ Yung W K，Zhang X，Steck P A，et al.Differential ampli－fication of the TGF－alpha gene in human gliomas［J］.Cancer Commun，1990，2（6）：201－205.

［14］ D’Amico T A，Harpole D H Jr.Molecular biology of esophageal cancer［J］.Chest Surg Clin N Am，2000，10（3）：451－469.

［15］ Imaizumi M，Nishimura M，Takeuchi S，et al.Role of tyrosine specific phosphorylation of cellular pro－teins，especially EGF receptor and p125FAK in human lung cancer cells［J］.Lung Cancer，1997，17（1）：69－84.

［16］ 肖玉霞，邵乐南，黄梅靖，等.PTPIP51、p－Raf－1及ERK1／2在口腔鳞状细胞癌中的表达［J］.华中科技大学学报：医学版，2011，40（4）：417－422.

［17］ Peyssonnaux C，Provot S，Felder－Schmittbuhl M P，et al.Induction of postmitotic neuroretina cell proliferation by distinct Ras downstream signaling pathways［J］.Mol Cell Biol，2000，20（19）：7068－7079.

［18］ Mason C S，Springer C J，Cooper R G，et al.Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf－1，but not B－Raf activation［J］.Embo J，1999，18（8）：2137－2148.

［19］ Li N，Batt D，Warmuth M.B－Raf kinase inhibitors for cancer treatment［J］.Curr Opin Investig Drugs，2007，8（6）：452－456.

［20］ Karasarides M，Chiloeches A，Hayward R，et al.B－RAF is a therapeutic target in melanoma［J］.Oncogene，2004，23（37）：6292－6298.

［21］ Lyons J F，Wilhelm S，Hibner B，et al.Discovery of a novel Raf kinase inhibitor［J］.Endocr Relat Cancer，2001，8（3）：219－225.

［22］ Ge X，Fu Y M，Meadows G G.U0126，a mitogen－activated protein kinase kinase inhibitor，inhibits the invasion of human A375melanoma cells［J］.Cancer Lett，2002，179（2）：133－140.

［23］ Schuh K，Pahl A.Inhibition of the MAP kinase ERK protects from lipopolysaccharide－induced lung injury［J］.Biochem Pharmacol，2009，77（12）：1827－1834.