鼠角膜缘干细胞3D 共培养模型的建立及生存率、表型维持

熊林杰， 郑 恬， 胡义珍

华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科，武汉 430022

外伤、化学烧伤、自身免疫性疾病等原因导致的角膜缘干细胞缺乏和缺失是常见而且严重的眼表疾病，角膜缘干细胞移植和重建是治疗许多眼表疾病的重要甚至是唯一的选择。移植和重建的效果很大程度上决定于角膜缘干细胞的植入方式、植入后存活率及其功能状态［1－2］。因此，如何促进角膜缘干细胞的存活和功能是值得研究的一个课题。角膜缘干细胞在体内生长的微环境是由各种不同的细胞和细胞外基质蛋白构成的一个有机整体，它们在促进角膜缘干细胞的存活和增生中发挥着不同的作用［3－4］。本实验中，我们用纤维蛋白模拟细胞外基质蛋白，用鼠胚胎成纤维细胞模拟鼠角膜缘干细胞周围的支持细胞，探讨通过小鼠角膜缘干细胞和纤维蛋白以及胚胎成纤维细胞的共同培养是否有助于提高角膜缘干细胞的生存率和其表型的维持。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及实验分组

1.1.1 鼠角膜缘干细胞的获取 采用显微手术获取10 只BALB／c小鼠（Charles River Laboratory）角膜缘，剪碎后胰酶消化10 min，300g 离心10 min，再将获取的细胞用RPMI－1640 培养液混匀。细胞计数后，按1×105／孔的密度将细胞种在6 孔板。1周后转移到10cm2的培养皿。将细胞培养于Celltrak培养板（Fisher Scientific）中，以兔抗鼠抗Integrinα9抗体（Santa Cruz）鉴定细胞表型。

1.1.2 鼠胚胎成纤维细胞的获取 将怀孕13.5d的母鼠麻醉处死，剥离子宫，将胚胎洗净后显微镜下剥离神经和内脏，保留躯干及四肢皮肤组织。使用刀片将其皮肤切碎，加入胰酶消化5～10min，培养液中和后1 000g离心5min，去上清后加新鲜培养液，培养到足够数目后，将其暴露于伽马射线1h以消除其分裂能力。

1.1.3 3D 细胞培养及实验分组 鼠角膜缘干细胞单独培养组（A 组）：将3×104角膜缘干细胞混合于300μL的培养液中，加入96 孔圆底培养板培养。鼠角膜缘干细胞与纤维蛋白共培养组（B 组）：将纤维蛋白原配成10mg／mL 的磷酸盐溶液，与鼠角膜缘干细胞混合成3×105／mL的混合悬液，取100μL细胞悬液加入96孔圆底培养板，再加入3μL 的50 U／mL的凝血酶，5min后小心加入200μL 的细胞培养液。鼠角膜缘干细胞、纤维蛋白和鼠胚胎成纤维细胞共培养组（C 组）：将鼠角膜缘干细胞与鼠胚胎成纤维细胞以1∶0.5的比例混合，制成含有10 mg／mL纤维蛋白原的4.5×105／mL 混合悬液，取100μL 加入96孔圆底培养板后再补充200μL 的培养液。以3×104个角膜缘干细胞单独培养（A组）作为对照组。

1.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率和存活率

细胞凋亡率和存活率采用Annexin Ⅴ－PE 凋亡检测试剂盒（Abcam Inc.）。细胞培养4、24、48h 后，用Sigma公司的纤维蛋白溶解酶消化鼠角膜缘干细胞共同培养的纤维蛋白，以1 000g 离心4min收集细胞，冷PBS洗2遍后，加入AnnexinⅤ抗体室温培育5min。采用流式细胞仪检测细胞凋亡和存活率，未被AnnexinⅤ和DAPI染色的细胞为存活细胞。被Annexin Ⅴ染色的细胞为凋亡细胞。

1.3 Western blot检测角膜缘干细胞分化蛋白的表达

对C 组的混合细胞，获得细胞后，加入抗CD16／32抗体于4℃孵育10min阻断细胞非特异性表面受体，然后加入抗表面抗原mCD49e抗体于4℃孵育30min，采用流式细胞仪分离技术，将表面抗原mCD49e阳性的胚胎成纤维细胞分离出来，剩余的细胞为与之共培养的小鼠角膜缘细胞。对A和B组细胞，用胰蛋白酶消化后，收集细胞。将收获的3组细胞，用等量的SDS细胞裂解液处理，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转到硝酸纤维膜（Bio－Rad Laboratories，Hercules）。硝酸纤维膜用含5%脱脂牛奶的0.05% PBS－tween（PBST）封闭30 min，然后将硝酸纤维膜浸入含一抗Keratin K3／K76（Millipore）的PBST 中，4℃过夜孵育。次日，PBST 清洗膜后，将硝酸纤维膜浸入辣根过氧化物酶偶联的兔IgG（Amersham Biosciences，Piscataway）（1∶3 000 稀释于含5% 脱脂牛奶的PBST中），室温下孵育2h。采用Western blot化学发光反应试剂（Perkin－Elmer LAS，Inc.）检测。胶片曝光后，采用VersaDoc影像系统（Bio－Rad Laboratories）扫描和定量分析。

1.4 统计分析

2 结果

2.1 细胞存活率和凋亡率检测

在细胞培养4、24 和48h，C 组细胞存活率最高，其值分别为（95.7±2.0）%、（95.1±1.2）%、（92.0±1.7）%，其凋亡率分别为（2.8±0.4）%、（3.3±0.5）%、（6.2±0.7）%。其次为B 组，其4、24 和48h生存率分别为（95.2±3.0）%、（89.8±1.5）%、（80.0±0.8）%，其凋亡率分别为（3.6±0.4）%、（9.2±0.8）%、（16.2±1.7.）%。存活率最低的组为A 组，其生存率分别为（95.0±1.2）%、（84.5±1.2）%和（70.0±0.9）%，其凋亡率分别为（3.8±0.4）%、（13.5±2.3）%、（27.3±2.7）%。见图1、2。

图1 流式细胞术检测细胞培养24h的凋亡率和存活率Fig.1 Apoptosis and viability of limbal stem cells after culture for 24h

图2 各组细胞培养不同时间点的存活率Fig.2 Statistical analysis of viability at different time points after culture

2.2 角膜缘干细胞分化蛋白的表达

分别在培养4h和48h后，收获和分离小鼠角膜缘干细胞，使用Western blot检测角膜分化蛋白Keratin K3／K76的表达。4h时各组细胞分化标记蛋白表达差异无统计学意义，而培养48h后C组的K3表达低于A 组和B组（n＝3，P＜0.05）。见图3。

图3 Western blot检测各组Keratin K3／K76的表达Fig.3 The expression of Keratin K3／K76detected by using Western blot in different groups

3 讨论

角膜缘干细胞在治疗各种严重的眼表疾病中有着广阔的应用前景［5］。在严重角膜缘干细胞缺乏症中，角膜缘干细胞移植是临床医生们最后和唯一的治疗手段［6－8］。当角膜缘干细胞植入后，最终的治疗效果主要取决于干细胞的生存率和它对自我表型的维持能力。由支持细胞和细胞外基质蛋白有机组成的微环境，以及它们的旁分泌作用对干细胞的存活和表型的维持有着决定性的作用［9－11］。在众多的干细胞培养中，例如鼠和人的胚胎干细胞，没有成纤维细胞的支持和旁分泌作用，它们很难维持其表型，其分化率和老化率都明显提高［12－14］。因此，我们猜测这种情形也可能发生于角膜缘干细胞［15－17］。

优化角膜缘干细胞生长的微环境是角膜缘干细胞移植成功与否以及改善预后的关键方法。为了取得更好的效果和预后，众多研究者使用不同的方法和材料，例如羊膜［18］、人工合成的多聚物等等［19］。本实验中，我们使用胚胎成纤维细胞与纤维蛋白作为新的手段去优化角膜缘干细胞的生长微环境。我们对3种不同培养模式下细胞的生存率和分化率进行了比较，结果显示角膜缘干细胞与纤维蛋白和胚胎成纤维细胞共同培养可以取得最高的生存率和最低的凋亡率，而角膜缘干细胞单独培养的生存率最低、凋亡率最高。因此我们认为，胚胎成纤维细胞和纤维蛋白可以优化鼠角膜缘干细胞的生长，有助于其表型的维持，防止或者减缓其分化。

3D 细胞培养是组织再生医学中广泛使用的活体细胞培养技术，与传统的2D 细胞培养技术相比较，它能给细胞提供类似机体内环境的机械支持力和生物化学微环境［20］。本实验中，我们采用简单易用的圆锥底培养皿3D 培养技术，在干细胞研究领域，许多研究者也采用它促进干细胞向胚胎小体的分化［21］。通过实验我们认为它可以增加纤维蛋白、胚胎成纤维细胞和角膜缘干细胞之间的相互作用，模拟角膜缘干细胞移植后的生长环境。

纤维蛋白是FDA 批准使用于人体的一种生物材料，高浓度的纤维蛋白可以作为粘合剂使用，因此它是适用于3D 培养的理想材料。但是它不含有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡和分化的生长因子［22－23］。在本实验中，我们发现与纤维蛋白共同培养的角膜缘干细胞的凋亡率低于对照组。因此我们推测纤维蛋白也许可以促进细胞之间的联系，优化它们的生长微环境。另外一个原因可能是纤维蛋白可以促进角膜缘干细胞与圆锥培养皿之间的粘附，从而减少角膜缘干细胞的脱落凋亡。由于纤维蛋白凝胶的浓度和硬度也会影响细胞的增殖和分化，高浓度和高硬度的凝胶可以明显抑制干细胞的增殖，阻止营养和氧气的渗入，因此在本实验中我们选用了低浓度和硬度的纤维蛋白凝胶作为我们3D 培养的模型构建材料。

鼠类胚胎成纤维细胞常常被用来作为干细胞培养的支持细胞，在人源性支持细胞和无支持细胞培养模式发明前，它也是人胚胎干细胞培养的支持细胞［24－25］。虽然它的作用原理还没有完全明了，但是一些实验表明目前成纤维细胞分泌的白细胞介素抑制剂，以及基本成纤维细胞生长因子对干细胞的表型维持，分化和凋亡的抑制有着决定性的作用。在本实验中，与鼠胚胎成纤维细胞共同培养的角膜缘干细胞取得了最高的生存率和最低的凋亡率，它意味着鼠胚胎成纤维细胞在体外培养中对鼠角膜缘干细胞的存活和表型维持有着促进作用，虽然现在具体的分子机制还不是很清楚，但是我们推测其分子机制应该与鼠胚胎成纤维细胞对鼠胚胎干细胞、人胚胎干细胞和诱导干细胞的作用相似。我们进一步推测角膜缘周围的支持细胞，比如结膜囊内的和Tenon 囊内的成纤维细胞应该比胚胎成纤维细胞在促进角膜缘干细胞生存和维持其表型方面有更好的效果，因为它们的生长环境与角膜缘干细胞更接近。因此，确定适宜的支持细胞种类和数量对于促进角膜缘干细胞的生存和表型的维持具有重要临床意义。

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