缝隙连接在TGF－β1诱导的自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用*

钟 华， 胡清华， 王恩帮， 赵 丹， 孙志萍， 司军强， 何 芳△

(1 新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室，石河子大学医学院2 病理生理教研室，3医学机能实验中心，新彊 石河子832002;4 华中科技大学同济医学院病理生理学系，卫生部呼吸系疾病重点实验室，湖北 武汉430030;5 郧阳医学院生理学教研室，湖北 十堰442000)

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖、迁移和表型变化导致的血管壁增厚和血管紧张度增加是高血压发病的关键。由缝隙连接蛋白(connexin，Cx)构成的细胞间直接通讯——缝隙连接(gap junction，GJ)在调节血管舒缩、血管平滑肌细胞增殖、平滑肌表型转变中起着重要作用，并与高血压发生密切相关［1］。我们前期的研究发现转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF - β1)血浆水平升高与高血压的发生密切相关［2］，在已研究证实的机制中均涉及细胞间通讯方式［2-4］。TGF-β1血浆水平升高是否通过改变Cx 的表达并调节缝隙连接通道的功能，影响细胞间直接通讯，导致血管平滑肌细胞增殖有待证实。基于上述情况，本研究以TGF-β1与自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rat，SHR)血管平滑肌细胞共孵育为细胞模型，配合使用缝隙连接通道的阻断剂18α-甘草次酸(18α-glycyrrhetinic acid，18α-GA)，应用染料示踪分子传递法、Western blotting、免疫荧光染色、流式细胞术和MTT 法，观察不同干预条件下缝隙连接蛋白表达和缝隙连接功能变化及对SHR 血管平滑肌细胞增殖的影响，阐明缝隙连接在TGF -β1诱导的SHR血管平滑肌细胞增殖中的作用及分子机制，为高血压的防治提供新靶标。

材 料 和 方 法

1 主要材料和试剂

1.1 材料 3 ～10 周龄，150 ～200 g 自发性高血压大鼠，雌雄不限，购自北京维通利华实验动物有限责任公司，许可证号为SCXK(京)2007 -0001。

1.2 主要试剂 DMEM 培养基(Gibco)，胎牛血清/小牛血清(HyClone)，胰蛋白酶(Sigma)，TGF - β1(Sigma)，18α-GA(Sigma)，抗α -actin 单克隆抗体(Dako)，抗Cx40 单克隆抗体(Invitrogen)，抗Cx43单克隆抗体(Invitrogen)，罗氏黄(lucifer yellow，LY;Molecular Probes)，罗丹明-葡聚糖(rhodamine-dextran，RD;Molecular Probes)，发光试剂盒(Pierce)。

2 方法

2.1 VSMCs 的培养和鉴定 取3 ～10 周龄，150 ～200 g 自发性高血压大鼠，雌雄不限，断头处死。无菌条件下取胸主动脉，以贴块法培养VSMCs，细胞生长融合后，用0.25%胰蛋白酶消化，以106～107/L的密度传代培养，对细胞进行形态学观察并对细胞内平滑肌肌动蛋白α - actin 进行免疫细胞化学染色，95% 以上的细胞呈阳性着色，证实细胞为VSMCs。取3 ～5 代细胞用于实验。

2.2 实验分组 将细胞以5 ×107/L 的密度培养24 h 后吸去孔内液体，加入无血清培养基，24 h 后再次吸去孔内液体，按以下分组加入试剂:(1)对照组:加10%FBS 的DMEM;(2)TGF -β1组:加10%FBS的DMEM 和10 μg/L TGF-β1;(3)缝隙连接阻断剂组:加含10%FBS 的DMEM 和50 mmol/L 18α-GA。(4)TGF-β1+缝隙连接阻断剂组:加含10%FBS 的DMEM、10 μg/L TGF-β1和50 mmol/L 18α-GA。

2.3 免疫荧光细胞化学检测Cx40 和Cx43 在细胞内表达及共定位 按实验分组制作细胞爬片，用PBS 洗3 遍，4%预冷的多聚甲醛固定20 min 后用含0.2% 非离子型表面活性剂Triton 的PBS 液洗3 遍，0.2%Triton X-100 室温透膜30 min，含0.2% Triton的PBS 洗3 遍，血清封闭30 min，含0.2% Triton 的PBS 洗3 遍，加入Cx40 (1∶100)和Cx43(1∶50)Ⅰ抗4 ℃湿盒内过夜，含0.2% Triton 的PBS 洗3 遍后，加入异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记Ⅱ抗(1∶50);四甲基异硫氰酸罗丹明(tetraethyrodamine isothiocyanate，TRITC)标记Ⅱ抗(1∶50)，室温避光孵育2 h，含0.2% Triton 的PBS 冲洗3 次，加核染料4'，6 -二脒基-2 -苯基吲哚(4'，6 -diamidino-2 -phenylindole，DAPI)(1∶1 000)室温避光孵育15 min，含0.2%Triton 的PBS 洗3 遍，60%缓冲甘油封片，激光共聚焦显徽镜下观察，实验中设立阴性对照、阳性对照和空白对照。

2.4 MTT 法检测VSMCs 的增殖活性 制备细胞悬液，用含10%FBS 的DMEM 液稀释成5 ×107/L，接种于96 孔板，每孔加入200 μL 混匀后的细胞悬液，置于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中孵育24 h。弃去培养液，用PBS 液冲洗1 ～2 遍。每孔加入不含FBS的DMEM 液，各200 μL，继续培养24 h，使细胞同步于G0/G1期。弃去培养液，分别按实验分组加入试剂，每组8 个复孔，置于培养箱培养24 h 后，各组弃去培养液，每孔加入MTT 20 μL，孵育4 h，加入二甲基亚砜(dimathyl sulfoxide，DMSO)150 μL，于酶标仪上检测各孔570 nm 处吸光度(A 值)。

2.5 流式细胞术检测细胞周期 在6 孔板内各组试剂作用24 h 后吸净孔内培养基，PBS 冲洗2 次，1 000 r/min 离心8 min，弃上清液加PBS 液吹打均匀，1 000 r/min 离心4 min，重复2 次，弃上清液加PBS 液吹打均匀，然后加入70%乙醇4 ℃过夜，至少18 h，1 000 r/min 离心5 min，加PBS 重悬离心同上，重复2 次后，加碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液0.5 mL，置于4 ℃，30 min 后上流式细胞仪，重复4次，进行细胞周期检测，通过特殊软件计算S 期的百分率，以反映细胞增殖能力。

2.6 Western blotting 法检测SHR VSMCs 内Cx40、Cx43 蛋白表达 在6 孔板内各组试剂作用24 h 后吸净孔内培养基，预冷PBS 冲洗3 次，加入细胞裂解液200 μL，吹打，转入1.5 mL EP 管中，保持冰上30 min 后4 ℃离心，12 000 r/min 离心10 min，取上清用5 ×加样缓冲液以4∶1 的比例稀释，煮沸6 ～8 min，BCA 法测蛋白质浓度进行蛋白质定量，-20 ℃保存。所有实验均独立重复3 次。以上蛋白样品(30 μg)经10 %聚丙烯凝胶电泳分离后，恒压25 V 电转移50 min 到硝酸纤维素滤膜(NC)上，然后封闭缓冲液(5%脱脂牛奶或牛血清白蛋白)中封闭1 h。将膜放入用5% 封闭液稀释的Ⅰ抗(Cx43 稀释比例为1∶1 000;Cx40 稀释比例为1 ∶200)中，在室温下孵育，持续摇动2 h。1 ×TBST(10mmol/L Tris - HCl，pH 7.4，150 mmol/L 氯化钠，0.05% Tween -20)洗膜，将膜用封闭缓冲液稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的第Ⅱ抗体(1∶2 000 稀释)，室温作用2 h，1 ×TBST 洗膜，新鲜配制的ECL 显色液1 mL(A、B液等体积混匀)和膜孵育1 min，封入保鲜膜中，压片，显影于感光胶片上。将经以上处理的NC 膜用洗脱缓冲液(strip buffer)室温孵育1 h 后，洗膜3 次，每次15 min。用β -actin 内参抗体(1∶1 000)室温孵育2 h，以同样方法显影于感光胶片。用Bandleader 3.0 软件对条带进行灰度扫描，按下述公式分别计算3 次实验中样品蛋白的相对含量:蛋白相对含量(该蛋白条带的灰度值-背景的灰度值)/(对照条带的灰度值- 背景的灰度值)，以此比值计算均数与标准差。

2.7 染料示踪分子传递法(划痕标记染料传输法)

检测血管平滑肌细胞间缝隙连接功能:在6 孔板内各组试剂作用24 h 后吸净孔内培养基，以37 ℃预温的PBS 冲洗细胞3 次，加荧光染料0.05%LY 和0.05%RD 的1∶1 混合液，每孔1 mL，用锐利的外科手术刀在细胞表面上划痕数条并计时，孵育3 min 吸出荧光染料，PBS 冲洗细胞3 次，然后加入少量PBS以刚好覆盖细胞为宜，荧光显微镜下观察，LY 荧光的显示用FITC 系统的滤光片，RD 用罗丹明系统滤光片，LY 荧光染料传递百分数=LY 荧光阳性细胞数(划痕细胞外)/划痕标记的细胞(即RD+LY 阳性细胞数)，重复实验3 次，统计分析后，以此代表缝隙连接功能的强弱。其大小代表细胞间缝隙连接通讯功能强弱。

3 统计学处理

结 果

1 免疫荧光技术检测SHR VSMCs 中Cx43 与Cx40 蛋白的表达及两者的共定位

共聚焦荧光显微镜下观察，绿色荧光为Cx43 的阳性着色，主要定位于胞浆，红色荧光为Cx40 的阳性着色，主要定位于胞浆与胞膜，橙色荧光为两者的重叠荧光，主要定位于胞浆，蓝色荧光显示为细胞核的DNA 染料(DAPI)阳性着色，可见SHR VSMCs 中Cx43 和Cx40 蛋白表达呈阳性，两者共定位于胞浆，见图1。

Figure 1. The expression and co-localization of Cx43 and Cx40 proteins in SHR VSMCs(×400).图1 SHR VSMCs 中Cx43 与Cx40 蛋白的表达及两者的共定位

2 VSMCs 的增殖

2.1 各实验组VSMCs 的增殖活性 与对照组相比，TGF-β1组的A 殖增高(P ＜0.05)，VSMCs 增殖活性增加，18α - GA 组的A 值降低(P ＜0.05)，VSMCs 增殖活性减少，TGF -β1+18α -GA 组A 值无明显差异(P ＞0.05);与TGF -β1组相比，TGF -β1+18α-GA 组A 值明显降低(P ＜0.05)，VSMCs增殖活性减少，见表1。

2.2 流式细胞仪检测细胞周期 结果显示:与对照组相比，TGF - β1组S 期比例增高(P ＜0.05)，VSMCs 增殖能力增加，18α-GA 组S 期比例降低(P＜0.05)，VSMCs 增殖能力减弱，TGF - β1+18α -GA 组S 期比例比无显著差异(P ＞0.05);与TGF -β1组相比，TGF-β1+18α -GA 组S 期比例明显降低(均P ＜0.05)VSMCs，增殖能力减弱，见图2、3。

表1 MTT 法测得各组SHR VSMCs 的A 值Table 1. The A values of SHR VSMCs in different groups detected by MTT(±s.n=10)

表1 MTT 法测得各组SHR VSMCs 的A 值Table 1. The A values of SHR VSMCs in different groups detected by MTT(±s.n=10)

* P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs TGF-β1 group.

Group A 570 Control 0.34 ±0.04 TGF-β1 0.39 ±0.04*18α-GA 0.27 ±0.02＊△TGF-β1 +18α-GA 0.31 ±0.02△

3 Western blotting 法检测SHR VSMCs 内Cx40和Cx43 蛋白表达

与对照组相比，TGF-β1组Cx43 蛋白表达增强(P ＜0.05)，Cx40 表达无显著差异(P ＞0.05)，18α-GA 组Cx43 和Cx40 表达均减弱(P ＜0.05)，TGF-β1+18α - GA 组Cx40 和Cx43 表达无显著差异(P ＞0.05);与TGF -β1组相比，TGF -β1+18α -GA 组Cx43 表达减弱(P ＜0.05)，Cx40 表达无显著差异(P ＞0.05)，见图4、5。

4 染料示踪分子传递法检测血管平滑肌细胞间缝隙连接功能

与对照组相比TGF -β1组，荧光染料传递分数增加，缝隙连接功能明显增强(P ＜0.05)，18α -GA组荧光染料传递分数降低，缝隙连接功能明显减弱(P ＜0.05)，TGF-β1+18α-GA 组荧光染料传递分数无明显差异，缝隙连接功能无显著差异(P ＞0.05);与TGF-β1组相比，TGF -β1+18α -GA 组荧光染料传递分数降低，缝隙连接功能显著降低(P＜0.05)，见图6、7。

Figure 2. The PI atlas of cell cycle of SHR VSMCs from different groups. A:control group ;B:TGF-β1 group;C:18α-GA agent group;D:TGF-β1 + 18α-GA group.图2 各组细胞细胞周期PI 图谱

Figure 3. The percentage of S - phase in cell cycle of SHR VSMCs from different groups. ±s.n =4. * P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs TGF-β1 group.图3 各组细胞细胞周期S 期所占百分数

Figure 4. Expression of the Cx43 and Cx40 proteins examined by Western blotting in SHR VSMCs from different groups. A:control group ;B:TGF - β1 group;C:18α - GA agent group;D:TGF - β1 + 18α - GA group.图4 各组Cx43 和Cx40 蛋白的表达

Figure 5. The expression of Cx43 and Cx40 proteins in VSMCs from different groups. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs TGF-β1 group.图5 各组Cx43 和Cx40 蛋白的表达

Figure 6. The atlas of gap junction function in VSMCs from different groups. A:control group ;B:TGF-β1 group;C:18α -GA agent group;D:TGF -β1 + 18α -GA group.图6 检测各组缝隙连接功能图

Figure 7. The percentage of fluorescent dye transfer in SHR VSMCs from different groups. ±s.n =3. * P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs TGF-β1 group.图7 各组荧光染料传递百分数

讨 论

血管平滑肌舒缩是依赖细胞间的信号物质进行调节的。平滑肌细胞之间相互调节作用除了由旁分泌及自分泌介导的间接通讯外，可能还涉及由缝隙连接介导直接通讯的作用［5］。

缝隙连接是由连接相邻两个细胞之间的连接通道排列而成的一种特殊膜结构。它由细胞膜上的连接子相互衔接而成，每个连接子由6 个Cx 围成，形成跨膜蛋白通道［6］。不同类型的连接蛋白可以形成不同类型的连接子，构成不同类型的连接通道，不同连接蛋白分子之间组合形成的缝隙连接通道的通透性和导电性有所不同［7］，从而使得缝隙连接在结构组成和功能上表现出多样性［8］，并对血管平滑肌舒缩等生理过程起着重要的调控作用。而血管平滑肌细胞以Cx43 和Cx40 表达为主。

TGF-β1是一种多功能细胞因子，能调节细胞增殖、分化，其作用取决于细胞密度、组织来源、TGF-β 浓度，对于血管平滑肌细胞的增殖以及介导高血压等心血管疾病的发生起着重要的作用。在我们前期的研究中显示:与正常血压大鼠组相比，SHR VSMCs A 值和S 期比例都明显升高，提示SHR 血管平滑肌细胞本身就处在增殖状态，且TGF - β1对SHR VSMCs 增殖活性具有明显的促进作用，并随着TGF- β1浓度的升高而逐渐增强［9］，与相关文献一致。

本实验中我们分别用TGF-β1和缝隙连接阻断剂18α-GA 处理SHR VSMCs，发现TGF -β1进一步促进了细胞的增殖，当缝隙连接阻断后，完全组断了TGF-β1对细胞的促增殖效应。本研究结果首次证实，缝隙连接可能参与了TGF - β1诱导的SHR VSMCs 的增殖作用。

为了进一步探讨TGF-β1是否通过改变连接蛋白的表达，调节缝隙连接通道的功能，影响细胞间直接通讯，并导致血管平滑肌细胞增殖，在本研究中我们用激光共聚焦显微镜观察Cx43 和Cx40 蛋白表达及定位，结果显示两者共定位于胞浆，并通过Western blotting 各组Cx43 和Cx40 的蛋白表达，结合划痕标记染料传输法检测了缝隙连接功能的变化，结果发现:TGF-β1处理使SHR 血管平滑肌细胞Cx43 蛋白表达上调，增强了缝隙连接通讯功能。缝隙连接阻断剂抑制了TGF-β1引发的Cx43 蛋白表达上调;并降低了缝隙连接功能，因此我们认为TGF -β1主要通过上调SHR 血管平滑肌细胞Cx43 蛋白表达，引起缝隙连接通讯功能增强，从而促进了SHR 血管平滑肌细胞的增殖作用，而Cx40 蛋白表达可能不起主要作用。

此外，缝隙连接功能的调节受多种因素的影响，如缝隙连接蛋白的表达、缝隙连接蛋白的磷酸化等，在本研究中我们仅就缝隙连接蛋白的表达做了初步研究，而缝隙连接在TGF -β1诱导的正常大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用及其机制有待进一步探讨。

［1］ Azzam EI，de Toledo SM，Little JB，et al. Direct evidence for the participation of gap junction mediated intercellular communication in the transmission of damage singals from α-particle irradiated to nonirradiated cells［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(2):473 -478.

［2］ 钟 华，何 芳，胡清华，等. ERK 和Smad 通路在TGF-β1抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用［J］. 中国病理生理杂志，2009，25(9):1665 -1670.

［3］ Lee S，Chen TT，Barber CL，et al.Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis［J］. Cell，2007，130(4):691 -703.

［4］ Hui DY. A No-No for Nono and JNK in extracellular matrix homeostasis and vascular stability［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27(8):1677 -1678.

［5］ Haefliger JA，Nicod P，Meda P.Contribution of connexins to the function of the vascular wall［J］. Cardiovasc Res，2004，62(2):345 -356.

［6］ Sohl G，Willecke K.Gap junctions and the connexin protein family［J］.Cardiovasc Res，2004，62(2):228 -232.

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［9］ 王恩帮，钟 华，罗小林，等. 缝隙连接在同型半胱氨酸介导的高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用［J］. 石河子大学学报:自然科学版，2011，29(4):475-478.