Rho激酶在阻断休克肠淋巴液回流、提高大鼠血管钙敏感性中的作用*

赵自刚， 牛春雨， 魏艳玲， 张玉平， 司永华， 张 静

(河北北方学院微循环研究所，基础医学院病理生理学教研室，河北 张家口 075029)

1000-4718(2012)01-0011-05

2011-07-29

2011-11-07

国家自然科学基金资助项目(No.30971203)

△通讯作者 Tel: 0313-4029168; E-mail：ncylxf@126.com

Rho激酶在阻断休克肠淋巴液回流、提高大鼠血管钙敏感性中的作用*

赵自刚， 牛春雨△， 魏艳玲， 张玉平， 司永华， 张 静

(河北北方学院微循环研究所，基础医学院病理生理学教研室，河北 张家口 075029)

目的观察Rho激酶在肠淋巴管结扎或肠淋巴液引流提高失血性休克大鼠血管钙敏感性中的作用。方法Wistar雄性大鼠随机分为假手术组(sham)、失血性休克组(shock)、休克肠淋巴管结扎组(shock+ligation，行肠淋巴管结扎)、休克肠淋巴液引流组(shock+drainage，行肠淋巴液引流)，在休克3 h或sham组的相应时点，制备肠系膜上动脉(SMA)血管环，采用离体血管环张力测定技术，观察SMA血管环对梯度钙离子收缩性的变化；shock+ligation与shock+drainage组SMA血管环分别与Rho激酶激动剂血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)、抑制剂fasudil孵育后，观察钙敏感性变化。结果Shock组SMA血管环的钙敏感性显著低于sham组；shock+ligation组与shock+drainage组SMA血管环钙敏感性显著高于shock组，但低于sham组。Shock+ligation组与shock+drainage组SMA血管环与AngⅡ或fasudil孵育后，AngⅡ不同程度地提高了shock+ligation组与shock+drainage组大鼠SMA血管环对梯度钙离子的收缩性与pD2；fasudil显著降低了两组大鼠SMA血管环对梯度钙离子的收缩性与最大收缩力Emax，降低了shock+ligation组的pD2。结论Rho激酶在阻断休克肠淋巴液回流提高血管钙敏感性中发挥重要作用。

休克，出血性； 肠淋巴管； 结扎术； 肠淋巴液； 引流术； 钙敏感性； Rho激酶

研究表明，休克肠淋巴液回流是进一步加重组织器官损伤的重要因素[1-3]，结扎休克大鼠的肠淋巴管或行肠淋巴液引流，均可减少重要器官组织炎症因子的产生，降低自由基损伤，改善组织器官功能[4-6]；血管低反应性是休克难以治愈的重要因素[7-8]，以肠淋巴管结扎或肠淋巴液引流阻断休克肠淋巴液回流，均可提高失血性休克(hemorrhagic shock，HS)大鼠的血管反应性，其机制与提高血管钙敏感性有关[9]；Rho激酶参与了失血性休克后血管低反应性与钙敏感性的调节[10-12]，而阻断休克肠淋巴液回流提高血管钙敏感性的机制是否与Rho激酶有关？值得研究。本文研究目的在于观察Rho激酶在阻断休克肠淋巴液回流提高血管钙敏感性中的作用。

材 料 和 方 法

1动物及分组

SPF级Wistar雄性大鼠30只，体重260～320 g(中国医科院实验动物繁殖中心)。所有大鼠实验前12 h禁食、自由饮水，随机分为假手术组(sham，n=6)、失血性休克组(shock，n=6)、休克肠淋巴管结扎组(shock+ligation，n=9)、休克肠淋巴液引流组(shock+drainage，n=9)。

2方法

大鼠肌肉注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)全身麻醉后，分离右侧股动脉和股静脉，股动脉插三通管，一端连接RM6240BD型生物信号采集系统(成都仪器厂)，用于监测平均动脉血压(mean blood pressure, MAP)，另一端用于放血，股静脉插管用于肝素化抗凝(500 U/kg)；行腹部手术，仔细分离肠淋巴管(mesentery lymph duct, MLD)与肠系膜上动脉(super mesenteric artery, SMA)；术后稳定30 min，10 min内放血使MAP至40 mmHg，维持3 h，复制大鼠重症休克模型。Shock+ligation组与shock+drainage组分别于放血前用我室常规方法行肠淋巴管结扎术和肠淋巴液引流术，sham组和shock组只在MLD下穿线不结扎。

3离体血管环制备

Shock组、shock+ligation组与shock+drainage组动物在维持3 h后、sham组动物在相应时点，迅速取出SMA，清除血管周围脂肪结缔组织，每只大鼠制备2根SMA血管环，长约2～3 mm；取sham组和shock组的12根血管环中不属于同一动物的6根用于钙敏感性测定(剩余6根用于其它实验)，shock+ligation组与shock+drainage组制备的18根血管环中，不属于同一动物的6根不作处理、6根与血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ，10-9mol/L，Sigma)孵育(作为ligation+ AngⅡ组或drainage+AngⅡ组)、6根与法舒地尔(fasudil，10-6mol/L，Alexis)孵育(作为ligation+ fasudil组或drainage+fasudil组)。

4钙敏感性观察

将SMA血管环挂于四腔离体血管器官灌流系统(成都仪器厂)的浴槽中，一端固定于槽底部，另一端通过张力换能器与生物信号采集系统相连，浴槽内液体为5 mL 37 ℃的K-H液(NaCl 118 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、glucose 11 mmol/L，pH 7.3～7.4)液，持续充入95%O2和5%CO2混合气体；孵育1.5 h后换高钾液(NaCl 2.7 mmol/L、KCl 120 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、glucose 11 mmol/L，pH 7.3～7.4)孵育15 min；ligation+ AngⅡ组、drainage+AngⅡ组、ligation+fasudil组、drainage+fasudil组分别与相关工具药预孵育10 min后，再换高钾液孵育15 min。待张力曲线稳定后，以浓度累积法依次加入不同浓度的Ca2+，使其终浓度依次为3×10-5、10-4、3×10-4、10-3、3×10-3、10-2、3×10-2mol/L，记录不同Ca2+浓度下血管环产生的最大收缩力(Emax)，以g/mg为量化标准，制作量效曲线，用曲线拟合法求Ca2+的EC50，用Ca2+达到50%最大反应时的负对数pD2(-lg[EC50])和Emax以及量效曲线评价血管的钙敏感性。

5统计学处理

结 果

1Rho激酶在肠淋巴管结扎提高休克大鼠血管钙敏感性中的作用

Shock组SMA血管环对梯度钙离子的收缩性、Emax值和pD2显著低于sham组(P<0.01)；shock+ligation组SMA血管环对各梯度钙离子的收缩性、Emax值显著高于shock组(P<0.01)，但对梯度钙离子(自10-4mol/L起)的收缩性、Emax值和pD2仍显著低于sham组(P<0.01)。Shock+ligation组SMA血管环与Rho激酶激动剂AngⅡ孵育后，对梯度钙离子的收缩性、Emax值和pD2均分别显著高于shock组，对钙离子(浓度为10-4、3×10-3、10-3mol/L时)的收缩性、pD2显著高于shock+ligation组，且对钙离子(浓度为10-4、3×10-3、10-2、3×10-2mol/L时)的收缩性及Emax值显著低于、pD2高于sham组(P<0.05，P<0.01)。与Rho激酶抑制剂fasudil孵育后，对梯度钙离子的敏感性、Emax值和pD2均显著低于sham组、shock+ligation组和ligation+AngⅡ组(P<0.01)，与shock组比差异无统计学意义(P>0.05)，见图1、表1。

图1Rho激酶在肠淋巴管结扎调节休克大鼠血管钙敏感性中的作用

表1Rho激酶在肠淋巴管结扎调节休克大鼠SMA血管环对钙离子Emax与pD2中的作用

GroupEmax(kg/g)pD2Sham0．87±0．123．59±0．11Shock0．44±0．09∗∗3．30±0．22∗∗Shock+ligation0．66±0．10∗∗##3．43±0．15Ligation+AngⅡ0．68±0．03∗∗##3．76±0．09∗∗##△△Ligation+fasudil0．44±0．03∗∗△△▲▲3．20±0．12∗∗△△▲▲

**P<0.01vssham;##P<0.01vsshock;△△P<0.01vsshock+ligation;▲▲P<0.01vsligation+AngⅡ.

2Rho激酶在肠淋巴液引流提高休克大鼠血管钙敏感性中的作用

如表2、图2示，shock+drainage组SMA血管环对梯度钙离子(自10-4mol/L起)的收缩性、Emax值显著高于shock组(P<0.05，P<0.01)，但对各浓度钙离子的收缩性、Emax值和pD2仍显著低于sham组(P<0.01)；shock+drainage组SMA血管环与Rho激酶激动剂AngⅡ孵育后，对梯度钙浓度的收缩性、Emax值和pD2显著高于shock组，对钙离子(浓度为3×10-5、10-4、3×10-4、10-3mol/L时)的收缩性和pD2显著高于shock+drainage组，对钙离子(浓度为3×10-3、10-2、3×10-2mol/L时)的收缩性和Emax值低于sham组、pD2高于sham组(P<0.01)；与Rho激酶抑制剂fasudil孵育后，除钙离子浓度为3×10-5mol/L时与shock+drainage组比无显著差异外，对梯度钙离子的敏感性和Emax值均显著低于sham组、shock+drainage组和drainage+AngⅡ组，pD2显著低于sham组和drainage+AngⅡ组(P<0.05，P<0.01)，与shock组相比均无显著差异(P>0.05)。

讨 论

随着对休克血管低反应性发生机制的深入研究，发现收缩性的高低不仅取决于血管平滑肌细胞内钙离子浓度，而且与钙的有效利用有着密切的关系；休克晚期血管平滑肌细胞内存在钙超载，并非低钙，说明钙敏感性降低参与了血管低反应性的形成[11]。徐竞等[12]复制失血性休克大鼠模型，以Rho为切入点，发现失血性休克血管存在钙敏感性降低的现象，Rho激酶激动剂可显著提高失血性休克大鼠血管的钙敏感性，而Rho激酶拮抗剂可显著降低钙敏感性。这些研究均表明钙失敏是失血性休克后血管低反应性的重要因素，且Rho激酶参与了失血性休克后钙失敏的发生。

图2Rho激酶在肠淋巴液引流调节休克大鼠血管钙敏感性中的作用

表2Rho激酶在肠淋巴液引流调节休克大鼠SMA血管环对钙离子Emax与pD2中的作用

GroupEmax(kg/g)pD2Sham0．868±0．1223．588±0．113Shock0．444±0．092∗∗3．295±0．220∗∗Shock+drainage0．655±0．052∗∗##3．284±0．076∗∗Drainage+AngⅡ0．663±0．011∗∗##3．830±0．030∗∗##△△Drainage+fasudil0．433±0．098∗∗△△▲▲3．239±0．208∗∗▲▲

**P<0.01vssham;##P<0.01vsshock;△△P<0.01vsshock+drainage;▲▲P<0.01vsdrainage+AngⅡ.

本文在已证实休克肠淋巴液回流是失血性休克大鼠血管反应性与钙敏感性降低的重要机制[9]的基础上，进一步使用Rho激酶工具药与执行肠淋巴管结扎或肠淋巴液引流后大鼠的SMA血管环共孵育，应用离体血管环张力测定技术，发现Rho激酶激动剂AngⅡ可不同程度地提高肠淋巴管结扎组或肠淋巴液引流组大鼠SMA血管环对梯度钙离子(尤其是在较低的几个钙离子浓度点)的收缩性与pD2；Rho激酶抑制剂fasudil则显著降低了肠淋巴管结扎或肠淋巴液引流后大鼠SMA血管环对梯度钙离子的收缩性与最大收缩力Emax，降低了肠淋巴管结扎组的pD2。研究结果提示，Rho激酶在阻断休克肠淋巴液回流提高血管钙敏感性中发挥一定的作用。

本研究也发现，AngⅡ对肠淋巴管结扎组或肠淋巴液引流组大鼠SMA血管环对梯度钙离子的Emax均未发挥作用，但fasudil却显著降低了两组大鼠SMA血管环对梯度钙离子的Emax，这也说明除Rho激酶发挥的作用之外，还可能存在其它因素的作用。有研究报道，肌球蛋白轻链(20-kD myosin light chain，MLC20)磷酸化水平与血管平滑肌钙敏感性的调节密切相关，Rho激酶和PKC均可抑制肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)活性，提高MLC20磷酸化水平，从而提高血管钙敏感性[13-15]。PKC、Rho激酶及其与MLC20磷酸化的关系在阻断休克肠淋巴液回流提升血管钙敏感性中的作用如何，还有待进一步观察。

同时，本研究也发现，肠淋巴管结扎组大鼠SMA血管环对梯度钙离子的pD2与sham组比无明显差异，而肠淋巴液引流组仍显著低于sham组；AngⅡ提高了肠淋巴管结扎组或肠淋巴液引流组大鼠SMA血管环对梯度钙离子的pD2；fasudil仅降低了肠淋巴管结扎组的pD2，但对肠淋巴液引流组pD2无明显作用。结果表明，肠淋巴管结扎提高血管钙敏感性的作用要强于肠淋巴液引流，其机制是否与肠淋巴液引流减少部分容量有关，还是有其它原因，还不清楚。

应当指出，阻断肠淋巴液提高了血管钙敏感性，而应用fasudil则拮抗了阻断休克肠淋巴液回流升高血管钙敏感性的这一作用，说明阻断肠淋巴液提高血管钙敏感性的作用与fasudil有关，而fasudil是Rho激酶的特异性拮抗剂，它的药理学作用是通过抑制Rho激酶来实现的[16-17]，这说明阻断休克肠淋巴液回流的作用与Rho激酶有关。而阻断休克肠淋巴液回流对SMA组织Rho激酶活性的影响有待在今后的实验中进一步观察。

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RoleofRhokinaseinblockingthereturnofmesentericlymphtoimprovevascularcalciumsensitivityinhemorrhagicshockrats

ZHAO Zi-gang, NIU Chun-yu, WEI Yan-ling, ZHANG Yu-ping, SI Yong-hua, ZHANG Jing

(InstituteofMicrocirculation,DepartmentofPathophysiology,BasicMedicalInstitute,HebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075029,China.E-mail:ncylxf@126.com)

AIM: To observe the role of Rho kinase in mesenteric lymph duct ligation or mesenteric lymph drainage to improve vascular calcium sensitivity in the rats subjected to hemorrhagic shock.METHODSMale Wistar rats were randomly divided into sham group, shock group, shock+ligation (shock plus mesenteric lymph duct ligation) group and shock+drainage (shock plus mesenteric lymph drainage) group. After induction of shock (hypotension at 40 mmHg) for 3 h, the vascular rings of superior mesenteric artery (SMA) were prepared and used to measure the response to gradient calcium ions for determining the calcium sensitivity with a wire myograph system. In shock+ligation group and shock+drainage group, the vascular rings were incubated with Rho kinase agonist angiotensinⅡ or antagonist fasudil before the measurement of the response to gradient calcium ions.RESULTSThe calcium sensitivity of vascular rings in shock group was significantly lower than that in sham group, and that in shock+ligation group and shock+drainage group was significantly higher than that in shock group, but still lower than that in sham group. AngⅡ elevated the contractile activity of the vascular rings in response to gradient calcium ions and the pD2, and fasudil significantly decreased the response to gradient calcium ions and Emaxin shock+ligation group and shock+drainage group. At the same time, fasudil decreased the pD2in shock+ligation group.CONCLUSIONRho kinase plays an important role in blocking shock mesenteric lymph return that improves calcium sensitivity.

Shock,hemorrhagic; Mesenteric lymph duct; Ligation; Mesenteric lymph; Drainage; Calcium sensitivity; Rho kinase

R364.1+4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.01.003