2 型糖尿病患者CD14 + CD16 + 单核细胞的水平及其对LPS 和IL－15 刺激的反应*

杨孟雪， 甘 华△， 沈 清， 汤为学

(1 重庆医科大学附属第一医院肾内科，2 重庆市神经病学重点实验室，重庆400016)

越来越多的研究表明，糖尿病患者体内存在细胞因子介导的慢性低度炎症反应状态。非特异性免疫系统激活参与2 型糖尿病(type 2 diabetic mellitus，T2DM)及其并发症的发生、发展其作用途径包括遗传变异、单核/巨噬细胞的促炎作用、慢性感染、Toll样受体(Toll－like receptor，TLR)途径、巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)水平增高等。CD14+CD16+单核细胞被认为是促炎性单核细胞亚群［1－2］。T2DM 慢性低度炎症时CD14+CD16+表达情况如何，少有报道。本研究的目的是探讨T2DM 患者体内CD14+CD16+单核细胞的比例及其对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和白细胞介素15(interleukin－15，IL－15)刺激的反应，以了解炎症性免疫反应在T2DM 中的可能作用机制。

材 料 和 方 法

1 研究对象

收集2009 年5 月～2011 年5 月正常对照组20例，男性10 例，女性10 例，平均年龄(49 ±6)岁，均为健康志愿者，经检查体格健康，并排除糖尿病、高血压、冠心病及肾病等内分泌代谢性疾病病史，均无糖尿病家族史。同时收集2009 年5 月～2011 年5月重庆医科大学肾内科及内分泌科T2DM 患者28例，男性15 例，女性13 例，平均年龄(52 ±8)岁，病程(4.4 ±1.9)年。糖尿病诊断均符合1999 年世界卫生组织(WHO)糖尿病诊断和分型标准。且符合以上标准的2 型糖尿病患者谷氨酸脱羧酶抗体(glutamic acid decarboxylase antibody，GADA)水平＜1.0，25－羟维生素D3［25(OH)D3］水平= 21 ～29 μg/L，空腹血糖低于7.0 mmoL/L，糖化血红蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)低于6.5%纳入。排除标准:(1)1型及继发性糖尿病;(2)急性感染性疾病;(3)心、肝功能不良;(4)近3 个月发生过糖尿病急性并发症及感染;(5)妊娠、哺乳;(6)其它肾病、结缔组织病和自身免疫性疾病;(7)肿瘤、心脑血管意外、哮喘、使用对研究有影响的药物等。所有入选者(表1)为中国汉族彼此间无亲缘关系的人群。本研究获得患者本人同意及重庆医科大学伦理委员会批准。

表1 2 组入选者的基线特征Table 1. Subject characteristics at baseline(±s)

表1 2 组入选者的基线特征Table 1. Subject characteristics at baseline(±s)

BMI:body mass index;HBA1c:hemoglobin A1c;LDL:low－ density lipoprotein;HDL:high－density lipoprotein;BP:blood pressure;BUN:blood urea nitrogen;SCr:serum creatinine;WBC:white blood cell;CRP:C－reactive protein;IL－6:interleukin－6;25(OH)D3:25－hydroxyvitamin D3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs healthy subjects.

Index Healthy subjects(n=20) T2DM patients(n=28)49±6 52±8 Male/female 10/10 15/13 Diabetes duration(year) 4.4±1.9 BMI(kg/m2) 23.1±1.9 22.4±3.1 HbA1c(%) 5.6±0.5 5.8±0.6 Fasting glucose(mmol/L) 5.5±0.9 5.9±0.8 Triglyceride(mmol/L) 1.6±0.5 1.9±0.7 Total cholesterol(mmol/L) 4.2±0.6 4.2±0.8 LDL－cholesterol(mmol/L) 2.6±0.6 2.2±0.6*HDL－ cholesterol(mmol/L) 1.2±0.5 1.1±0.2 Systolic BP(mmHg) 134±6 136±9 Diastolic BP(mmHg) 76±9 76±8 BUN(mmol/L) 5.6±0.7 5.7±1.5 SCr(μmol/L) 69.0±9.1 68.1±14.6 WBC(×109/L) 5.9±0.7 5.4±1.4 Neutrophils(×109/L) 3.0±0.4 2.9±0.6 Monocytes(×109/L) 0.3±0.1 0.3±0.1 CRP(mg/L) 1.7±0.7 3.3±1.6＊＊IL－6(ng/L) 11.0±2.0 55.5±17.1＊＊25(OH)D3(μg/L) 45.7±7.8 25.1±2.5 Age(year)＊＊

2 主要试剂

RPMI－1640 培养基、胎牛血清均购自Gibco，人淋巴细胞分离液1.077 及LPS 均购自Sigma，重组人IL－15 购自PeproTech。藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的抗人分化群(cluster of differentiation，CD)14 和异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的抗人TLR4 抗体均购自AbD Serotec，鼠单克隆信号转导和转录激活子5(signal transducer and activator of transcription 5，STAT5)和磷酸化STAT5(phosphorylated STAT5，p－STAT5)抗体均购自Santa Cruz。羊抗小鼠β－actin 抗体购自北京四正柏公司。山羊抗小鼠和兔抗山羊Ⅱ抗均购自北京中杉金桥公司，IL－6 和单核细胞趋化蛋白－1(monocyte chemotactic protein－1，MCP－1)的ELISA 检测试剂盒由Biosource 提供。25 (OH)D3的ELISA 检测试剂盒由R＆D 提供。GADA 测定:采用BioMerica试剂盒，用酶联免疫法测定。HbA1c 测定:采用化学发光法，应用Diastar 糖化血红蛋白分析仪检测。血常规应用XE－2100 全自动分析仪检测。空腹血糖、血脂、肾功能及高敏C 反应蛋白(high－sensitive C－reative protein，hsCRP)的测定:空腹抽取静脉血，采用奥林巴斯全自动生化分析仪检测。

3 主要方法

3.1 血标本的采集及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)的分离和培养 采集研究对象晨起空腹静脉血，低温离心，取血清，置－80 ℃冰箱保存待用。剩余静脉血置于肝素抗凝的试管中，用于流式检测及PBMCs 的分离。Ficoll 淋巴细胞分离液密度梯度离心分离出外周血PBMCs，加入完全RPMl－1640 培养基(含10%的热失活胎牛血清，青霉素及链霉素各1 ×106U/L)制成细胞悬液，混匀后进行细胞计数及台盼蓝鉴定细胞活力(至少＞95%)。调整细胞浓度为2 ×108/L 接种至24孔板然后置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养，用于后续实验。

3.2 实验分组 分离外周血单个核细胞接种培养于24 孔板中，RPMl－l640 培养基(含10%的热失活胎牛血清、青霉素及链霉素各1 ×106U/L)培养24 h后每组均加入1 mg/L LPS 和100 μg/L 重组人IL－15 干预4 h(每个样本做2 个复孔):(1)健康对照组(n=20);(2)T2DM 组(n =28)。LPS 联合IL－15干预4 h 后收集PBMC 和培养液。LPS 和IL－15 的浓度选择参照预实验和文献［3－4］。

3.3 流式检测CD14+CD16+单核细胞平均荧光强度值(mean fluorescence intensity，MFI) 取EDTA 抗凝的外周全血150 μL 加入流式管底，预留1 管作为空白对照管，不加荧光抗体，其余各管分别加入相应的抗体(CD14－PE 和CD16－FITC 各10 μL)，振荡混匀后避光，室温孵育;在上述液体内分别加入红细胞裂解液;然后洗涤细胞;每管内加入多聚甲醛固定;流式细胞仪上检测CD14+CD16+的MFI。同时使用同型对照使其能够有效确保抗体的特异性。

3.4 Western blotting 检测STAT5 和p－STAT5 蛋白表达 冰上裂解细胞，BCA 法测定蛋白浓度。总蛋白上样于12%SDS－PAGE 电泳分离，电转移至PVDF 膜上，以含5%脱脂奶粉的TBST 封闭后，分别加入小鼠抗人STAT5 抗体和小鼠抗人p－STAT5 抗体及羊抗小鼠β－actin 抗体，4 ℃过夜，洗膜，分别加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠和兔抗山羊IgG 孵育，扫描仪成像，自动成像系统分析。

3.5 荧光显微镜下观察单个核细胞p－STAT5 蛋白表达 干预前和干预结束后，PBS 清洗细胞，4%多聚甲醛固定，牛血清封闭，0.3%Triton X－100 透膜处理5 min，1∶200Ⅰ抗(小鼠抗人p－STAT5 抗体)4 ℃孵育过夜，1∶50 荧光Ⅱ抗(FITC 标记的山羊抗小鼠IgG)孵育1 h，DAPI 孵育10 min，荧光显微镜摄像。

3.6 细胞因子检测 ELISA 法检测外周血和上清液IL－6 及MCP－1 的浓度，按照ELISA 试剂盒操作说明操作，IL－6 和MCP－1 含量计算结果以ng/L表示。试剂的批内分析和批间分析变异系数均＜10%，所有样本设3 个复孔。

4 统计学处理

用SPSS 16.0 统计软件进行分析。数据用均数±标准差(± s)表示，两个连续变量的关系作Spearman's 相关分析，两组间比较采用t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 病人的基线特征

2 组间年龄、性别、体重指数、HbA1c、空腹血糖、血压、肾功能、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、外周血白细胞和单核细胞绝对计数无显著差异(P ＞0.05);T2DM 患者外周血低密度脂蛋白、25(OH)D3、IL－6 及hsCRP 水平高于正常对照人群(P ＜0.01)，见表1。

2 CD14+CD16+单核细胞的平均荧光强度

如图1 所示，T2DM 组的CD14+CD16+单核细胞的平均荧光强度值显著高于正常对照组(T2DM组6.9 ±2.3;正常对照组4.6 ±1.5)，P ＜0.01。

3 LPS 和IL－15 干预后STAT5 和p－STAT5 蛋白的表达

LPS 和IL－15 干预4 h，T2DM 组PBMC p－STAT5 蛋白水平表达上调，与正常对照组比较，差异显著(T2DM 组0.37 ±0.08，正常对照组0.12 ±0.04，P ＜0.05)。但STAT5 总蛋白表达2 组比较没有明显差异(P ＞0.05)，见图2。

4 LPS 和IL－15 干预前后PBMC 中p－STAT5蛋白表达的变化

LPS 和IL－15 干预前T2DM 患者PBMC 核内不表达p－STAT5，经过LPS 联合IL－15 干预后T2DM患者细胞核内有p－STAT5 的表达，提示p－STAT5处于激活状态，但健康对照组LPS 与IL－15 干预前后细胞核内均无p－STAT5 表达，见图3。

Figure 1. MFI of CD14 +CD16 + expression in monocytes from the two groups. A:healthy subjects;B:type 2 diabetes (T2DM)patients.a:identification of monocytes displayed in a representative FSC/SSC dot plot;b:flow cytometry analysis of isotypematched control antibody;c:a representative flow cytometry chart of CD16 expression by CD14－positive monocytes. MFI of CD14 +CD16 + =c/b.图1 2 组CD14 +CD16 +单核细胞MFI 的表达

Figure 2. The expression of STAT5 and p－STAT5 protein in LPS－ and IL－15－treated PBMC. 1:healthy subjects;2:T2DM patients.图2 LPS 和IL－15 干预后PBMC STAT5 和p－STAT5 的表达

5 LPS 和IL－15 干预后PBMC 培养上清液中IL－6 和MCP－1 水平

LPS 和IL－15 干预后，T2DM 组PBMC IL－6 和MCP－1 水平均明显高于正常对照组(P ＜0.01)，见表2。

6 相关分析

T2DM 组外周血CD14+CD16+单核细胞数量明显高于正常对照组(P ＜0.01)，并与血清CRP 和IL－6水平呈正相关(r=0.394，P ＜0.05 和r=0.741，P ＜0.01)，与25(OH)D3浓度呈负相关(r =－0. 409，P ＜0.01)，且25(OH)D3水平与CRP 和IL－6 水平呈负相关(r=－0.479 和r=－0.774，均P ＜0.01)。

表2 LPS 和IL－15 干预后PBMC 培养上清中IL－6 和MCP－1 水平Table 2. The cell supernatant IL－6 and MCP－1 levels in LPS－and IL－15－treated PBMC from the two groups(ng/L. ±s)

表2 LPS 和IL－15 干预后PBMC 培养上清中IL－6 和MCP－1 水平Table 2. The cell supernatant IL－6 and MCP－1 levels in LPS－and IL－15－treated PBMC from the two groups(ng/L. ±s)

* P ＜0.05 vs healthy subjects.

Group n IL－6 MCP－1 Healthy subjects 20 20.3 ±8.5 18.9 ±8.2 T2DM pratients 28 49.6 ±13.5* 29.1 ±10.4*

讨 论

最近的一些相关研究［5－7］表明单核/巨噬细胞、炎症可能与T2DM 及其并发症的发生发展存在密切关系。在过去几年，多项研究［8－10］已经显示T2DM、炎症与维生素D 缺乏症间存在联系。维生素D 与糖尿病之间的相关性研究是一个新的研究领域。自从在胰岛B 细胞和免疫细胞中发现维生素D 受体后，越来越多的证据表明维生素D 缺乏的个体更易患糖尿病。流行病学研究显示，生命早期的维生素D 缺乏与将来1 型糖尿病的发病存在联系，而补充维生素D 可以预防1 型糖尿病，改善2 型糖尿病的血糖控制。

Figure 3. Expression of p－STAT5 in LPS－and IL－15－treated PBMC.A:p－STAT5 expression in PBMC from T2DM group before LPS and IL－15 treatment;B:p－STAT5 expression in PBMC from T2DM group after LPS and IL－15 treatment.a:FITClabeled p－STAT5 ;b:DAPI－labeled nucelus;c:merged.图3 LPS+IL－15 对p－STAT5 在PBMC 中表达的影响

对T2DM 动物模型ob/ob 大鼠的研究证实，维生素D 缺乏时胰岛素的分泌被抑制，补充维生素D 以后，胰岛素水平增加，血糖水平下降［11］。另有研究显示，1，25－(OH)2D3可以显著下调T2DM 患者单核细胞中TNF－α、IL－6、IL－l 和IL－8 的表达，从而证明1，25－(OH)2D3可以调节T2DM 患者单核细胞的炎性反应状态［12］。

DM 的相关体外研究发现，来自1 型DM(T1DM)和T2DM 的单核细胞具有促炎特性，表达炎症因子的能力增强［13－14］。本研究结果显示，与正常对照组相比，T2DM 组外周血CD14+CD16+单核细胞荧光强度值与CRP 和IL－6 水平呈正相关，与25(OH)D3浓度呈负相关，且25(OH)D3水平与CRP和IL－6 水平均呈负相关。IL－15 和LPS 刺激后，检测T2DM 患者PBMC 培养上清IL－6 和MCP－1水平，均高于正常对照组，CD14+CD16+单核细胞被认为是促炎性单核细胞亚群，这表明CD14+CD16+单核细胞的异常表达可能与T2DM 的微炎症状态相关，这一微炎症状态可能与患者体内维生素D 不足有关。

IL－15 是1994 年由Grabstein 发现的可溶性细胞因子，它分布较广泛，尤其在单核/巨噬细胞系统表达最多。IL－15 在很小剂量(10 μg/L)即能诱导中性粒细胞的形态发生改变，呈典型的活化细胞形态，从而证明IL－15 能够启动细胞骨架的重排［15－16］。Alleva 等［17］的研究表明，IL－15 作为一种单核因子通过自分泌的方式作用于单核巨噬细胞，而且单核巨噬细胞对IL－15 的剂量变化非常敏感。高浓度的IL－15(10 ～1 000 μg/L)能增加LPS 活化的单核巨噬细胞产生促炎(proinflammatory)因子(如IL－1、IL－6 和TNF－α)，而低浓度的IL－15(＜1.0 μg/L)能选择性地抑制促炎因子的产生。

STAT5 是胞浆中潜在的转录因子。在无刺激情况下，细胞内无p－STAT5 表达;在细胞因子、生长因子等外界信号分子的刺激下，STAT5 发生磷酸化和二聚化进入细胞核，结合在基因特定的启动子上调控转录。IL－6、IL－15 等细胞因子与细胞表面的相应受体结合后，可立即激活胞质内与受体偶联的Janus 激酶(Janus kinase，JAK)，继而迅速引起STAT5的酪氨酸磷酸化，启动下游的一系列效应［18］。

本研究以IL－15 和LPS 为外界信号分子刺激单核细胞，发现经过LPS 和IL－15 干预4 h，与正常对照组相比，T2DM 组单核细胞p－STAT5 蛋白表达上调，且IL－6 和MCP－1 水平均明显高于正常对照组。本研究还发现T2DM 患者单核细胞STAT5 分子在IL－15 和LPS 刺激前无胞核分布，刺激后发生磷酸化聚集于胞核中，可能是由于构象的改变暴露了核定位序列形成同源或异源二聚体，而促进磷酸化的STAT5 入核，从而参与单核细胞趋化因子和炎症因子等的合成和分泌的调节。而正常对照人群LPS和IL－15 干预前后改变差异不明显。本研究得出的结果与Hormann 等［19］的类似。

本研究显示IL－15 和LPS 可能是PBMC 释放炎症因子和趋化因子的重要刺激因素，IL－15 和LPS 通过增加PBMC 内IL－6 和MCP－1 的生成，激活p－STAT5 信号通路从而参与并放大了动脉粥样硬化炎症免疫反应，这可能是糖尿病患者易患冠心病、糖尿病肾病等动脉粥样硬化性疾病的重要原因之一。

以上结果提示在T2DM 患者体内可能存在单核细胞功能紊乱，这种功能紊乱可能与活性维生素D3不足有关，二者可能参与了T2DM 患者体内免疫炎症反应并与微炎症互为因果，从而导致了T2DM 及其并发症的发生发展。其作用机制可能与STAT5 信号通路的激活有关。因此，后续工作我们将针对性地对以上途径进行研究，深入探讨T2DM 患者单核细胞与微炎症的关系，及炎症调节的机制，以便为T2DM 及其并发症的预防和改善提供新线索。

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