四逆散有效组分改善睡眠作用与5-羟色胺能神经系统相关性的实验研究

张 乔 金 阳 徐瑞鑫 李廷利

1.黑龙江中医药大学药学院中药药理教研室，黑龙江哈尔滨 150040；2.黑龙江省哈尔滨市食品药品检验检测中心，黑龙江哈尔滨 150525

四逆散出自于《伤寒论》少阴病篇，为仲景名方。组方柴胡、枳实、芍药、甘草四味，临床应用广泛[1]。近年来有学者针对四逆散做了许多临床和药理学研究工作，根据本实验室近期的研究来看，四逆散有非常明确的改善睡眠的作用[2]。为进一步阐明基于5-HT能神经系统的四逆散有效组分改善睡眠的作用机制，笔者现通过四逆散有效组分对脑内5-HT能神经系统的多种物质含量的影响，表明其相关性。

1 仪器与试药

1.1 实验动物

KM种小鼠，清洁级，雄性，体重（23±2）g，由黑龙江中医药大学GLP实验室提供。

1.2 实验药物

四逆散有效组分的组成成分：辛弗林、芍药苷、柴胡皂苷C、甘草次酸（均由成都思科华生物技术有限公司提供），四者比例关系为8∶1∶1∶5，临用前用含2%吐温-80的生理盐水配制成66.00 mg/mL浓度溶液，现用现配。

1.3 主要实验试剂

5-羟色氨酸：（Aladdin，批号：30817）；对氯苯丙氨酸：（Sigma，批号：C6506）。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 阈下剂量5-HTP联合阈下剂量四逆散有效组分对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 取KM种小鼠60只，随机分成4组，分别为空白组、四逆散有效组分组、5-HTP组以及四逆散有效组分+5-HTP组（即为联合组），每组15只，连续给药4 d，给药途径均为腹腔注射。四逆散有效组分组和联合组分别给予四逆散混合有效组分溶液（16.50 mg/mL，165.00 mg/kg，腹腔注射）；空白组和5-HTP组给予等体积生理盐水，5-HTP组和联合组均在注射戊巴比妥钠前15 min给予5-HTP（2.5 mg/mL，25 mg/kg，腹腔注射），各组末次给药30 min后，腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg，分别记录各组小鼠入睡的潜伏期及睡眠持续时间。

2.1.2 四逆散有效组分联合PCPA对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 取KM种小鼠60只，随机分成4组，分别为空白组、四逆散有效组分组、PCPA组以及四逆散有效组分+PCPA组（即为联合组），每组15只，连续给药4 d，给药途径均为腹腔注射。四逆散有效组分组和联合组分别给予四逆散混合有效组分溶液（66.00 mg/mL，660.00 mg/kg，腹腔注射）；空白组和PCPA组给予等体积生理盐水，PCPA组和联合组均在注射戊巴比妥钠前24 h行皮下注射PCPA（30 mg/mL，300 mg/kg，皮下注射），所有各组末次给药30 min后，腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg，分别记录各组小鼠入睡的潜伏期及睡眠持续时间。

2.1.3 四逆散有效组分对小鼠前额叶皮质、海马和下丘脑等不同脑区5-HT和5-HIAA含量的影响 取KM种小鼠30只，随机分成2组，即空白组和四逆散有效组分组，每组15只，四逆散有效组分组分别给予四逆散混合有效组分（66.00 mg/mL，660.00 mg/kg，腹腔注射），空白组注射等体积生理盐水，连续给药4 d，末次给药后30 min，断头取脑，低温分离前额叶皮质、海马和下丘脑，分析天平称重，加入9倍生理盐水匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液，酶联免疫吸附（Elisa）法测定其中5-HT和5-HIAA的浓度。

2.2 统计学方法

实验数据采用SPSS 13.0软件包处理，计量资料数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析（Oneway-ANOVA），两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.3 结果

2.3.1 阈下剂量四逆散有效组分联合5-HTP对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 阈下剂量四逆散有效组分联合5-HTP对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响结果表明，与空白组比较，四逆散有效组分组以及5-HTP组小鼠无论从睡眠潜伏期均有缩短的趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）；在睡眠持续时间上均有延长的趋势，但统计学上无显著变化（P>0.05）。但是，当阈下剂量四逆散和5-HTP联合应用时，与空白组比较，小鼠的睡眠潜伏期明显缩短（P<0.05），睡眠持续时间显著延长（P<0.05）。见表1。

表1 四逆散有效组分联合阈下剂量5-羟色氨酸（5-HTP）对小鼠睡眠时间的影响（±s）

表1 四逆散有效组分联合阈下剂量5-羟色氨酸（5-HTP）对小鼠睡眠时间的影响（±s）

注：与空白组比较，*P<0.05

组别 样本数 潜伏期（s）睡眠持续时间（min）空白组四逆散有效组分组5-HTP组四逆散有效组分+5-HTP 15 15 15 15 228.9±93.7 215.4±68.1 173.0±36.9 130.6±48.2*44.5±20.8 60.2±30.1 50.3±15.0 84.9±20.5*

2.3.2 四逆散有效组分联合PCPA对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 睡眠潜伏期的实验结果表明，与空白组比较，四逆散有效组分组小鼠睡眠的潜伏期明显缩短（P<0.05）。睡眠持续时间的实验结果表明，与空白组比较，四逆散有效组分组可以显著延长小鼠睡眠时间（P<0.05），而PCPA组的睡眠持续时间明显缩短（P<0.05）。另联合组与空白组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 四逆散有效组分联合对氯苯丙氨酸（PCPA）对小鼠睡眠时间的影响（±s）

表2 四逆散有效组分联合对氯苯丙氨酸（PCPA）对小鼠睡眠时间的影响（±s）

注：与空白组比较，*P<0.05；与四逆散有效组分组比较，#P<0.05

组别 样本数 潜伏期（s）睡眠持续时间（min）空白组四逆散有效组分组PCPA组四逆散有效组分+PCPA 15 15 15 15 293.2±127.6 192.1±48.9*211.7±45.5 272.3±83.9 58.5±12.1 79.3±24.5*37.8±9.8*62.3±18.8#

2.3.3 四逆散有效组分对小鼠不同脑区5-HT以及5-HIAA含量的影响 实验结果表明，与空白组比较，四逆散有效组分组小鼠前额叶皮质区5-HT的浓度明显升高（P<0.05），而海马区和下丘脑部位的5-HT浓度则无明显变化（P>0.05）。与空白组比较，，四逆散有效组分组小鼠前额叶皮质脑区的5-HIAA浓度显著降低（P<0.05），海马部位和下丘脑区5-HIAA浓度的虽然都有下降的趋势，但是差异无统计学意义（P>0.05）。见表3、4。

表3 四逆散有效组分对小鼠不同脑区5-羟色胺（5-HT）浓度的影响（±s，ng/g）

表3 四逆散有效组分对小鼠不同脑区5-羟色胺（5-HT）浓度的影响（±s，ng/g）

注：与空白组比较，*P<0.05

组别 样本数5-HT前额叶皮质 海马 下丘脑空白组四逆散有效成分组15 15 1 019.1±431.8 1 435.7±458.3*990.5±395.8 1 005.7±289.0 1 198.4±639.0 1 068.2±336.6

表4 四逆散有效组分对小鼠不同脑区5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）浓度的影响（±s，ng/g）

表4 四逆散有效组分对小鼠不同脑区5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）浓度的影响（±s，ng/g）

注：与空白组比较，*P<0.05

5-HIAA前额叶皮质 海马 下丘脑空白组四逆散有效组分组15 15 167.26±31.11 140.86±19.87*164.90±23.92 158.15±32.61 166.61±31.13 150.29±36.39

3 讨论

中枢5-HT能神经系统作为直接或间接参与睡眠生理调节的主要神经递质之一，在睡眠和觉醒调节方面起重要作用[3]。脑内5-HT主要来自中缝核上部，其前体物质是色氨酸，经色氨酸羟化酶的作用形成5-HTP（5-羟色氨酸），后者在5-羟色胺酸脱羧酶的作用下生成5-HT。因此，破坏5-HT能神经末梢或抑制色胺酸羟化酶的作用，会阻断脑内5-HT的合成，外在表现失眠状态。若在此期间注射5-HT的前体物质5-HTP（5-羟色氨酸），则失眠可恢复至正常。

本实验结果显示阈下剂量的5-HTP和四逆散有效组分分别应用存在作用趋势，无显著性差异，但二者联合应用时，产生协同作用，可明显延长戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠时间，由此可见，四逆散有效组分对小鼠睡眠的影响与增加脑内5-HT前体物质5-HTP的含量有关。

PCPA是小鼠脑内5-HT合成酶——色氨酸羟化酶的抑制剂，能够阻断脑内5-HT的合成，使5-HT浓度降低，是导致小鼠睡眠时间缩短的主要原因[4]。本实验结果显示PCPA明显缩短戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠持续时间；当四逆散有效组分联合PCPA给药时，显示比较四逆散有效组分组睡眠持续时间明显缩短（P<0.05），但睡眠持续时间接近空白组。因此说明PCPA具有明显拮抗四逆散有效组分延长小鼠睡眠时间的作用，即四逆散有效组分对睡眠的影响同样和脑内5-HT合成酶抑制剂PCPA相关。

5-HIAA是5-HT的代谢产物。脑内的5-HT是通过单胺氧化酶使5-HT脱胺生成5-羟吲哚乙醛，再经醛脱氢酶催化生成5-HIAA；5-羟吲哚乙醛还可还原生成5-羟色醇，由肾脏排除。二是由突触膜对5-HT的再摄入作用[5]。本实验研究表明，四逆散有效组分使5-HT含量增加，5-HIAA含量减少，虽二者上升和下降数量关系不等，但作用趋势符合上述的生化代谢[6]。因此，以上研究结果表明四逆散有效组分对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的作用与5-HT能神经系统的相关性尤为密切，更进一步机制尚待深入证实。

[1]罗辉昌.四逆散方证实质研究[D].北京：北京中医药大学，2005.

[2]李越峰.四逆散改善睡眠作用药效物质基础研究[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学，2009.

[3]Jouvet M.The role of monoamines and acetylcholine-containing neurons in the regulation of the sleep-waking cycle[J].Ergeb Physiol，1972，64：166-307.

[4]Zhao X，Cui XY，Chen BQ，et al.Tetrandrine，a bisbenzylisoquinoline alkaloid from Chinese herb Radix，augmented the hypnotic effect of pentobarbital through serotonergic system[J].Eur J Pharmacol，2004，506（2）：101-105.

[5]周舒，娄艾琳.5-羟色胺的生理和病理生理[M].北京：人民卫生出版社，1988：6，103.

[6]刘蓓蓓，张蕴琨.运动与脑组织中5-羟色胺及其代谢物的研究现状[J].南京体育学院学报：自科版，2005，4（4）：29-33.