辣椒素诱导HSP27高表达结肠癌SW480细胞凋亡机制

黄崇杰，姜爱琴，刘长宝

大肠癌是常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率有明显上升趋势[1]。治疗以外科手术为主，但对中晚期的患者，化疗成为必须的辅助治疗。化疗对大肠癌的疗效不一，且毒副作用较大。近年来，有关辣椒素抗癌作用的研究在国内外日益受到重视，已有体外研究发现，辣椒素能明显抑制人胰腺癌、肝癌细胞生长[2-3]，辣椒素对肠癌细胞的作用效果及机制尚未阐明。本研究以HSP27 高表达的人结肠癌SW480 细胞为研究对象，观察辣椒素对结肠癌细胞凋亡的诱导作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人结肠癌细胞SW480 购自中科院上海分院；辣椒素购自美国Sigma 公司；RP-MI1640 培养基、0.05%的胰酶、购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma 公司；CCK-8 细胞计数试剂盒购自日本同仁化学研究所；Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基公司；逆转录PCR 试剂盒购自Fermanats 公司；β-actin 鼠抗人抗体、兔抗人HSP-27、兔抗人Active-caspase3 抗体、兔抗人Active-caspase9抗体购自英国Abcam公司；HRP标记的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG 购自美国Santa Cruz 公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，ECL 化学发光显色试剂盒购自美国Pierce 公司、显影定影试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SW480细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，饱和湿度、37 ℃、5%CO2培养箱内常规传代培养。待细胞生长至约70%～90%的融合状态用于实验。

1.2.2 药物配制 将12.2 mg 的辣椒素粉剂溶于100 μL 的DMSO 溶剂(二甲基亚砜)，配制成4×105μmol/L的母液，-20 ℃冰箱保存，用不含血清的培养基稀释母液，配制成终浓度为100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L 的辣椒素用于实验(各组含药培养基中DMSO终体积分数均小于0.1%)。

1.2.3 细胞生长抑制实验 取对数生长期的细胞，经胰酶消化后吹打成单细胞悬液，调整浓度为5×104/mL，接种于96孔培养板中，每孔100 μL，每组设8个复孔。实验分为空白调零对照组(不含细胞)、正常对照组、溶剂对照组(含终体积分数为0.1%DMSO)和终浓度为100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L的辣椒素组，细胞经24 h贴壁，更换成无血清培养基培养24 h进行细胞同步化，再更换成上述含药培养基继续培养24 h、36 h、48 h 后，每孔加入CCK-8 试剂10 μL，培养作用1 h 后用酶标仪于450 nm波长测吸光度值(A值)。取8 孔平均值，计算抑制率。细胞抑制率IR(100%)=[1-(实验组A值-空白对照组A 值)/(正常对照组A 值-空白对照组A值)]×100%。

1.2.4 流式细胞仪检测 将细胞分为正常对照组、溶剂对照组(0.1%DMSO)和终浓度为100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L的辣椒素组，经药物处理24 h后，将悬浮细胞以及用胰酶消化下来的贴壁细胞收集在一起，制成单细胞悬液，离心弃上清液用PBS轻轻重悬细胞并计数1×105个细胞。按照Annexin V-FITC凋亡试剂盒说明书，对细胞进行Annexin V-FITC 和碘化丙啶(propidiumiodide, PI)染色。避光10 min，使用流式细胞仪进行检测(激发波长488 nm，发射波长530 nm)，Annexin V 单阳性为早期凋亡细胞，分析软件CellQuest计算细胞早期凋亡率。

1.2.5 RT-PCR 检 测 细 胞HSP27、casepase-3、casepase-9 mRNA 的表达 收集20 cm2培养皿内经300 μmol/L辣椒素处理0 h、12 h、24 h、36 h、48 h后的细胞，Trizol 提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA 浓度，按照Fermanats 试剂盒产品说明书操作合成cDNA后进行PCR反应。PCR反应体系(见表1)，PCR 扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳观察。凝胶影像分析系统扫描照片，条带用Gelprol32软件分析，以目的片段与内参扩增片段条带的光密度积分值的比值来评定各mRNA的表达水平。

表1 PCR热循环反应体系（预变性均为94 ℃，5 min ；延伸均为72 ℃，1 min 最后一循环72 ℃，5 min）

1.2.6 Western blot 检 测 HSP27、casepase-3、casepase-9 蛋白的表达 细胞经300 μmol/L 辣椒素作用0 h、24 h、36 h和48 h后用胰酶消化收集细胞，离心弃上清，PBS 漂冼2 次。用含1%PMSF 的RIPA细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白，BCA 分析试剂测定样品总蛋白浓度，调整蛋白浓度，煮沸变性10 min。每组各取100 μg总蛋白样品，以12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。将分离的蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS封闭2 h。兔抗人HSP27抗体和兔抗人casepase-3、casepase-9抗体(1∶500)4 C°孵育过夜，TBST洗膜15 min×2 次后加HRP 标记的山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG(1∶500)，常温孵育2 h，TBST 洗膜15 min×2 次。用增强化学发光法显色，X线片曝光显影。β-actin作为内参照标化蛋白质表达。用Quantity One 凝胶成像分析系统进行半定量分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0 软件包，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组资料比较采用ANOVA单因素方差分析，组间两两比较方差齐者采用LSD-t检验，方差不齐者采用Dunnett'sT3检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 辣椒素对体外培养的人结肠癌SW480 细胞株的生长抑制作用 采用CCK-8 法检测SW480 细胞增值，结果显示，与正常对照组比较，0.1%DMSO 组作用24 h、36 h、48 h 均无统计意义(P ＞0.05)，表明0.1%体积分数的DMSO 对细胞无明显毒性作用；与正常对照组及0.1%DMSO 组比较，100 μmol/L 辣椒素组作用24 h、36 h 无统计学意义(P ＞0.05)，作用48 h 有统计学意义(P ＜0.05)(见表2)。余各浓度各时间点辣椒素作用于细胞后，其生长抑制率均有统计学意义。

表2 不同浓度辣椒素对SW480细胞的生长抑制作用(x±s,%)

2.2 辣椒素对SW480 细胞早期凋亡的影响 用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡，不同浓度辣椒素及0.1%DMSO作用于SW480细胞24 h后，流式细胞仪检测分析。结果显示，0.1%DMSO 组与正常对照组比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)；辣椒素能诱导SW480 细胞早期凋亡，其早期凋亡率在100～300 μmol/L浓度时逐渐升高。而400 μmol/L时却较300 μmol/L 低，与正常对照组及0.1%DMSO 组比较，除100 μmol/L 辣椒素组外，其余各组均有统计学意义(P ＜0.05, P ＜0.01)。300 μmol/L 辣椒素组与200 μmol/L、400 μmol/L辣椒素组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。见图1。

2.3 辣 椒 素 对SW480 细 胞HSP27、casepase-3 及casepase-9 mRNA 表达的影响 与正常组相比，300 μmol/L浓度辣椒素作用细胞后HSP27 mRNA表达水平随辣椒素作用时间延长而下调，casepase-3及casepase-9 mRNA 表达则呈作用时间依赖性上调，其中36、48 h 组差异显著(P ＜0.01)。见图2，表3。

图1 不同浓度辣椒素对SW480细胞早期凋亡的影响

图2 辣椒素对SW480细胞HSP27、caspase-3、caspase-9 mRNA表达的影响

表3 辣椒素对SW480细胞HSP27、caspase-3、caspase-9 mRNA表达的影响(x±s，n=6)

2.4 辣 椒 素 对SW480 细 胞HSP27、casepase-3 及casepase-9 蛋白表达的影响 与正常对照组相比，300 μmol/L 浓度辣椒素作用细胞后，HSP27 蛋白表达水平随辣椒素作用时间延长而下调，活化casepase-3 及casepase-9 的表达则呈作用时间依赖性上调，其中36 h、48 h 组差异显著(P ＜0.01)。见图3，表4。

图3 辣椒素对SW480细胞HSP27、caspase-3、caspase-9 蛋白表达的影响

表4 辣椒素对SW480细胞HSP27、caspase-3、caspase-9蛋白表达的影响(x±s，n=3)

3 讨论

诱导细胞凋亡是大多数化疗药物作用的主要机制[4-5]，但多药耐药及严重的化疗副作用是化疗失败或停止化疗的主要原因。从天然植物中寻找高疗效、低不良反应及改善生存质量的药物，已成为抗癌药物研究的热点之一。辣椒素又称辣椒碱，是红辣椒中的一种活性成分，其结构为反式8-甲基-N-香草基-丁-壬烯胺。近年来，国外相继有文献报道了辣椒素在肿瘤防治方面的作用，引起了广泛重视。Wu 等[6]通过对食管表皮样癌CE81T／VGH 细胞株体外实验，发现辣椒素通过抑制细胞周期素依赖性激酶CDKII和细胞周期素(cyclin)E复合体的形成，诱导细胞周期G0/G1期阻滞。Mori等[7]报道，辣椒素可以抑制人前列腺癌裸鼠模型新生肿瘤的形成。现在相继有报道显示，辣椒素可以引起多种肿瘤细胞的凋亡，包括胰腺癌、肝癌、乳腺和前列腺癌等[1-2,8-9]。但辣椒素引起肿瘤细胞凋亡的确切机制仍然不明确。现有的国内外文献重点研究了辣椒素对凋亡正向调控蛋白和周期阻滞的影响。为了证实辣椒素诱导细胞凋亡的作用并探讨其其它的机制，本实验研究了辣椒素对凋亡负调控蛋白HSP27 的作用以及对caspase凋亡信号通路的影响，以体外培养的人结肠癌SW480 细胞为研究对象，通过CCK-8 检测，结果表明，辣椒素对结肠癌细胞的生长具有较强的抑制作用，抑制率呈明显的时间、剂量依赖关系。不同浓度辣椒素作用于细胞24 h，流式细胞仪检测发现，药物溶剂0.1%DMSO 组和低浓度剂量辣椒素(100 μmol/L)对细胞的作用不明显，早期凋亡率与正常对照组比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)。而中高浓度剂量的辣椒素，可以诱导细胞发生凋亡，随着剂量的升高，表现为先增加后降低的趋势。其中300 μmol/L 浓度组的早期凋亡率最高，与对照组相比，差异有统计学意义(P ＜0.01)。所以，做为最佳诱导剂量，用于后续的相关凋亡蛋白表达的检测。

热休克蛋白(heat shock protein, HSP)又称应激蛋白，是指细胞在应激情况下所产生的一组序列高度保守的蛋白质，广泛存在于原核和真核生物中，应激状态下可被诱导表达。大量研究表明，其在肿瘤组织中的表达较正常组织明显增高。最近的蛋白组学研究表明，HSP27在结直肠癌中的过表达，与化疗耐药和预后不良存在必然联系[10]。Tsuruta等[11]研究发现，大肠癌细胞HSP27 的表达与5-FU 耐药成正相关，下调HSP27 的表达可以增加5-FU 的敏感性，细胞内HSP27 表达增高与大肠癌发生、发展有关，可能是大肠癌发展、恶化的重要标志。HSP27 对肿瘤细胞的保护作用，目前普遍认为是通过它的抗凋亡作用来实现的[12-13]。Concannon 等[14]通过免疫共沉淀实验证明，HSP27 与细胞色素C 和caspase-3 酶原相螯合，阻止了凋亡小体复合物的正确形成以及其功能的执行。实际上，HSP27 结合于从线粒体释放入胞质的细胞色素C，阻止了细胞色素C-介导的Apaf-1与caspase-9酶原的互作，从而特异的干扰了caspase依赖型细胞凋亡的线粒体通路。Rocchi等[15]发现，在前列腺癌细胞中，HSP27 表达下调会导致caspase-3 活性的增加，进而抑制了细胞的生长，验证了HSP27 能够调节caspase-3 的活性。而有文献报道，辣椒素能通过caspase蛋白酶依赖途径来诱导人乳腺癌MCF-7 细胞凋亡[16]。本实验同时研究了辣椒素对HSP27、caspase3、caspase9 的作用，初步探讨其可能存在的相关性，通过RT-PCR 和Western blot检测了辣椒素对SW480细胞Hsp27、casepase-3、casepase-9 mRNA 及蛋白水平表达的影响，发现辣椒素可下调HSP27 蛋白的表达、同时伴随casepase-3、casepase-9 蛋白表达增高，作用36 h、48 h 时较为明显，与正常组相比，差异显著(P ＜0.01)。表明辣椒素可能通过抑制HSP27 的表达而直接诱导癌细胞凋亡，或通过下调HSP27 的表达，从而增加caspase-3、caspase-9 的活性，进而抑制了细胞的生长，诱导细胞凋亡的发生。但辣椒素作用于HSP27 的具体机制，以及对caspase-3、caspase-9上游通路的作用，有待进一步研究。

本实验进一步证实了辣椒素的体外抗癌作用，表明辣椒素能明显抑制人结肠癌细胞SW480 细胞的生长并诱导凋亡，调节HSP27、casepase-3、casepase-9蛋白的表达可能是其作用机制之一。

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