响应面法优化超声辅助提取宣木瓜总皂苷提取工艺研究

潘国波，杨小明，丁 艳，李媛媛，韩邦兴

1江苏大学食品与生物生物工程学院;2江苏大学化学化工学院;3江苏大学药学院，镇江212013

蔷薇科木瓜属Chaenomeles Lindl，共约有5种，我国均产［1］。药典记载的正品木瓜为贴梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai的近成熟果实，因烫晒干燥后皮面多皱褶，故又称为皱皮木瓜。主产于安徽、浙江、湖北、四川等地，其中产于安徽宣城者质量最佳，习称宣木瓜。中医认为宣木瓜可去湿除痹，是治疗久风顽痹之要药［2］。现代医学研究证明宣木瓜中主要药效成分为皂苷类物质，具有护肝降酶、抗炎、促免疫、抗菌、抗肿瘤等活性［3-8］。目前国内对木瓜皂苷的提取通常采用乙醇溶剂浸提和超声辅助回流提取［9］，超声辅助回流提取较乙醇溶剂浸提能够有效缩短提取时间，增加提取效率，但是尚没有超声辅助回流提取宣木瓜皂苷工艺的报道。因此，本文采用超声辅助回流提取法提取宣木瓜皂苷，用响应面法对各主要影响因子提取时间、温度、乙醇浓度和料液比之间的单一和交互作用等进行了较深入的研究，得出最佳的提取工艺参数，为宣木瓜皂苷以后的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

宣木瓜，采购于安徽省宣城市，经江苏大学药学院韩邦兴教授鉴定为正品宣木瓜;齐墩果酸标准品，购自中国药品生物制品检定所，纯度≧95%(批号110709-200304);无水乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸均为分析纯。

分光光度计(VIS-7220);恒温水浴锅(HH-S型);电热恒温鼓风干燥箱(DHG9140A型);冰箱(合肥荣事达电冰箱厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 单因素实验对宣木瓜总皂苷提取条件的优化

1.2.1.1 乙醇浓度对宣木瓜总皂苷得率的影响:准确称取1.00 g宣木瓜干粉6份分别置于100 mL三角瓶中，固定提取时间30 min，提取温度40℃，料液比1:30 g/mL，乙醇浓度依次40%、50%、60%、70%、80%、90%，超声200 W，恒温水浴提取。

1.2.1.2 料液比对宣木瓜总皂苷得率的影响:准确称取1.00 g宣木瓜干粉5份分别置于100 mL三角瓶中，固定提取时间30 min，提取温度40℃，乙醇浓度70%，料液比依次1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL，超声200 W，恒温水浴提取。

1.2.1.3 提取时间对宣木瓜总皂苷提取率的影响:准确称取1.00 g宣木瓜干粉6份分别置于100 mL三角瓶中，固定温度40℃，料液比1∶30 g/mL，乙醇浓度70%，提取时间依次为15、30、45、60、75、90 min，超声200 W，恒温水浴提取。

1.2.1.4 提取温度对宣木瓜总皂苷提取率的影响:准确称取1.00 g宣木瓜干粉6份分别置于100 mL三角瓶中，固定提取时间60 min，料液比1∶30 g/ mL，乙醇浓度 70%，提取温度依次30、40、50、60、70、75℃，超声200 W，恒温水浴提取。

1.2.2 总皂苷含量测定香草醛高氯酸法

1.2.2.1 标准曲线的测定

按文献［10］建立的宣木瓜总皂苷含量测定方法进行计算。回归方程为:y=0.0182x+0.0481，R2= 0.9949，线性范围为0.016～0.12 mg/mL。

1.2.2.2 提取液中总皂苷含量的测定

将每次所得提取液，按照1.2.2.1分析方法处理后，用无水乙醇定容至100 mL。从中吸取适量，按标准曲线测定项测定方法进行总皂苷含量的测定。

1.2.3 数据分析

试验数据的处理均采用Design Expert 8.0.5软件进行分析［11-13］。

2 结果与讨论

2.1 响应面分析法优化工艺设计与实验结果

根据单因素实验的结果，采用 Design-Expert 8.0.5统计分析软件中Central Composite Design设计四因素三水平的响应分析实验。试验因素与水平设计见表1。

提取温度、料液比、提取时间和乙醇浓度对宣木瓜总皂苷得率的影响结果见表2。

应用Design-Expert 8.0.5软件对表2中的数据进行多元回归拟合。进行显著性检验，结果见表3。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Independent variables and their levels used for Box-Behnken central composite design

表2 响应面法设计与试验结果Table 2 Box-Behnken central composite design for independent variables and their response

16 0 1 1 0 1.4363 17 -1 0 -1 0 1.3071 18 1 0 -1 0 1.4088 19 -1 0 1 0 1.3978 20 1 0 1 0 1.4555 21 0 -1 0 -1 1.4060 22 0 1 0 -1 1.3786 23 0 -1 0 1 1.4335 24 0 1 0 1 1.3950 25 0 0 0 0 1.5626 26 0 0 0 0 1.5544 27 0 0 0 0 1.5434

提取温度(X1)、液料比(X2)、提取时间(X3)和乙醇浓度(X4)与皂苷得率之间的二次多项回归方程:

表3 回归方程系数及其显著性检验Table 3 Analysis of mean square deviation of regress equation and significant test

回归方差分析显著性检验表明，提取温度、提取时间两因素对皂苷得率的线性效应最显著;提取温度和乙醇浓度因子间交互作用比较明显。在本实验设计范围内，该模型回归显著(P＜0.0005)。模型的复相关系数为 0.9153，说明该模型能解释91.53%响应值的变化，即该模型与实际实验拟合良好，试验误差小，证明应用响应曲面法优化的提取工艺提取宣木瓜总皂苷是可行的。

2.2 宣木瓜皂苷提取率的响应曲面分析和优化

由图1可直观地看出提取温度和乙醇浓度的交互作用较显著。等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。

对回归方程求导，并令其等于零，可以得到曲面的最大点，即三个主要因素的最佳水平值，分别为: X1=0.23、X2=0.06、X3=0.17、X4=0.05，转换后得到提取的最佳条件为:温度62.34℃、料液比1: 30.57 g/mL、乙醇浓度 70.49%、提取时间61.69 min，其相对应的皂苷含量为1.56%。

图1 各因素交互作用对总皂苷得率的影响Fig.1 Correlative effects of different factors on triterpenoid saponins yield

2.3 模型响应值的验证

为了检测试验结果是否与真实情况相一致，根据以上试验结果进行近似验证实验，考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为温度60.00℃、料液比1:30.00 g/mL、乙醇浓度70.00%、提取时间60.00 min，其相对应的皂苷含量为1.55%，与理论预测值相比，其相对误差约为0.65%，因此，采用响应面法优化得到的提取条件准确可靠，具有使用价值。

2.4 超声波辅助提取和热醇回流提取法的比较

将筛选出来的最优工艺与传统热醇回流提取法进行比较，提取条件和宣木瓜总皂苷得率见表4。

表4 不同提取方法对总皂苷得率的影响Table 4 Effect of different extraction methods on triterpenoid saponins yield

3 结论

本实验在单因素试验的方法上，采用响应面试验设计方法对超声辅助提取宣木瓜总皂苷的工艺进行优化。实验得到的模型的回归模型显著，失拟误差不显著，说明通过本实验所建立的二次回归方程能较好地描述各因素和响应值之间的关系。依据回归分析结果得到的宣木瓜总皂苷的提取条件为:温度62.34℃、料液比 1∶30.57 g/mL、乙醇浓度70.49%、提取时间61.69 min，在此条件下得到的预测提取率为1.55%，跟实际值基本一致。

超声辅助提取技术不仅操作简便，所需时间短，提取温度低，而且皂苷提取率较高，还能避免中药有效成分在提取过程中被破坏，效果较理想，因此在中药制剂的提取工艺中运用越来越受到重视。通过与热醇回流提取法的比较，超声辅助提取的皂苷得率提高了近25%，说明超声辅助提取技术能够有效地提高宣木瓜皂苷的得率，为宣木瓜皂苷以后的研究提供参考。

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