吉林长白山刺五加总皂苷超声提取工艺研究

杜 琨，陈锦屏

1陕西师范大学食品工程与营养科学学院，西安710062;2武警工程大学军事经济系，西安710086

刺五加是五加科刺五加属的重要的药用植物之一，主要分布在我国吉林、黑龙江、辽宁等地。我国刺五加资源丰富，特别是长白山地区因为得天独厚的区域生态条件，为野生刺五加的生长提供了良好自然环境［1，2］。刺五加果实是中药中的上品，又为第三代果品，含有丰富的营养成分和药理活性，研究发现，刺五加果实含有皂甙、胡萝卜素苷等多种生物活性成分［3-5］。近年来，皂甙因其具有良好的生物活性和多种药理功效而备受关注，对其进行合理开发利用具有重要意义。超声提取主要是利用超声波的搅拌效应和空化效应等加速活性成分的溶出，目前超声提取技术在皂甙的提取工艺研究中得到广泛应用，但刺五加果实的超声提取工艺未见报道，本试验拟建立一种简便、快捷的长白山野生刺五加果实总皂甙提取和测定方法，为野生刺五加新产品开发研究及深加工提供参考，以利于东北刺五加产业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺五加果实，于当年10月份采自吉林长白山地区，经陕西师范大学食品工程与营养科学学院段玉峰教授鉴定为刺五加;齐墩果酸对照品(中检所购买);甲醇、乙醇、正丁醇、高氯酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山超声仪器厂);电热恒温水槽(上海福玛试验设备有限公司);紫外-可见分光光度计(上海精密仪器有限公司);RE-52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂); ALPHA2-4冷冻干燥机(德国Marin Chris公司)。

1.3 刺五加果实总皂甙提取工艺流程

刺五加果实→干燥→粉碎→超声提取→提取液过滤浓缩→水饱和正丁醇萃取→清液蒸发浓缩→甲醇溶解定容至25 mL→稀释后显色测定含量

1.4 标准曲线的绘制

1.4.1 对照品溶液的制备

精密称取齐墩果酸对照品5.24 mg置于5 mL量瓶中加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即可。

1.4.2 供试品溶液的制备［6］

精密量取样品1 mL，置于已处理好的树脂柱(内径1.5 cm，填充高度16 cm，AB-8型大孔吸附树脂，乙醇装柱，用水洗尽乙醇)，按3 M/min流速，以水70 mL洗脱;继用70%乙醇洗脱，弃去初流出液5 mL，收集洗脱液50 mL，置水浴上蒸干。残渣以甲醇溶解，定量移入5 mL量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

精密量取对照品溶液、供试品溶液各60 μL，分别置于试管中，挥干，精密加入8%香草醛乙醇溶液0.5 mL，72%硫酸5 mL，摇匀，置60℃恒温水浴加热10 min，取出试管置冰水浴中冷却15 min，以溶剂60 μL同样操作制备空白，于500～600 nm波长范围内扫描。对照品溶液和供试品溶液在540 nm波长处均有最大吸收，故选540 nm为检测波长。

1.4.3 线性关系考察

精密称取齐墩果酸对照品5.24 mg，置5 mL量瓶中加甲醇溶液并稀释至刻度，摇匀。精密量取20、40、60、0、100、120 μL分别置于试管中，同样操作，于540 nm处测定吸收度［6］，以刺五加皂甙含(ug)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线得到标准曲线方程:Y=0.0032X+0.0158，R=0.9975

1.5 总皂甙得率的测定方法

精确称取处理得到的样品1 mL，用30%的乙醇溶解后，按“标准曲线的绘制”的方法进行操作，并以空白样为对照，在540 nm出测定其吸光度，根据回归方程计算出刺五加总皂甙的得率(mg/g)。

1.6 提取条件的单因素试验

影响超声提取野生刺五加总皂甙的因素很多，本试验因条件所限，选取料液比、乙醇浓度、超声功率、超声时间4个主要因素做单因素试验，考察它们对刺五加总皂甙的提取效果。

1.7 超声波提取正交优化条件试验

在单因素的基础上，选取料液比、乙醇浓度、超声功率、超声时间进行正交试验优化，从中筛选出最佳工艺条件和技术参数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以刺五加标准品为标准，得到标准曲线方程为Y=0.0032X+0.0158，R=0.9975，其中y为吸光度为纵坐标，X为刺五加皂甙质量浓度(mg/mL)。

2.2 提取条件的单因素试验

2.2.1 料液比对超声提取总皂甙得率的影响

在超声功率400 W，提取温度45℃，乙醇体积分数60%，提取时间20 min的条件下，分别选取料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35(g/mL)进行超声提取试验，结果见图2。由图2可知，当料液比超过1∶20时，提取率增加平缓，说明刺五加总皂甙基本溶出，再增加料液比，总皂甙得率变化不大，还会给后续的纯化造成一定的困难，所以料液比选取1∶20。

图1 料液比对粗提物中总皂甙得率的影响Fig.1 Effects of raw material-to-liquid ratio on the content of total saponins in crude extract

2.2.2 乙醇体积分数对超声波提取总皂甙得率的影响

在超声功率400 W，提取温度45℃，料液比1∶20，提取时间20 min的条件下，分别选取乙醇体积分数为50%、60%、70%、80%、90%进行超声提取试验，结果见图3。由图3可知，当乙醇体积分数为70%时，溶剂对总皂甙的提取效果最好。因此，选择乙醇体积分数70%较为适宜。

图2 乙醇体积分数对粗提物中总皂甙得率的影响Fig.2 Effects of ethanol concentration on the yield of total saponins in crude extract

2.2.3 超声功率对提取效果的影响

在提取温度45℃，料液比1∶20，提取时间20 min，乙醇体积分数为70%的条件下，分别选取超声功率150、250、350、450、550、650、750 W进行超声提取试验，结果见图4。由图4可知，在一定范围内，总皂甙得率随着超声功率的增大而增加，但超声功率增加到一定程度就会破坏总皂甙的结构，反而不利于提取，因此选择超声功率为450 W。

图3 超声功率对粗提物中总皂甙得率的影响Fig.3 Effects of ultrasonic power on the yield of total saponins in crude extract

2.2.4 超声时间对提取效果的影响

在超声功率450 W，提取温度45℃，料液比1∶20，乙醇体积分数为70%的条件下，分别选提取时间10、20、30、40、50、60 min进行超声提取试验，结果见图5。由图5可知，随着超声时间的增长，总皂甙得率呈递增趋势，这主要是由于超声时间较短时，刺五加总皂甙不易溶出，但超声时间过长，总皂甙得率增加不明显，综合考虑超声时间为40 min。

图4 提取时间对粗提物中总皂甙得率的影响Fig.4 Effects of extraction time on the yield of total saponins in crude extract

2.3 正交试验优化提取条件

选用L9(34)正交表进行试验，并以总皂甙得率为考察指标，试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素及水平Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

表2 L9(34)正交实验设计及结果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance of orthogonal array design experimental results

由正交试验结果和方差分析综合分析可知，长白山刺五加果实总皂甙超声提取最佳工艺参数为料液比1∶20、乙醇体积分数70%、超声波功率450 W、超声提取时间50 min。各因素对总皂甙提取效果影响的权重依次为料液比＞超声波功率＞乙醇体积分数＞超声提取时间。

3 结论

3.1 将超声波提取应用于长白山野生刺五加果实中粗总皂甙含量的提取和测定，测得刺五加总皂甙含量为3.57 mg/g。如采用单纯的溶剂浸提法测得总皂甙的含量为2.12 mg/g，因此超声波辅助提取应用于此效果良好。

3.2 正交试验结果显示各因素对总皂甙的提取影响顺序依次为料液比＞超声波功率＞乙醇体积分数＞超声提取时间。因此长白山野生刺五加果实总皂甙提取的最佳工艺为料液比1∶20、乙醇体积分数70%、超声波功率450 W、超声提取时间50 min。该提取方法简便、快捷，可用于长白山野生刺五加果实总皂甙提取和测定。

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7 Zhang N(张娜)，Chen JP(陈锦屏)，Yan J(严静)，et al.Process optimization for the ultrasonic extraction of total saponins from hetian-jadejujnhe.Food Sci(食品科学)，2011，32:108-112.