朱砂根抑制α-葡萄糖苷酶与抗氧化活性研究

李园园，李 锟，2，王俊霞，康文艺*

1河南大学中药研究所，开封475001;2黄河科技学院，郑州450063

朱砂根Ardisia crenata为紫金牛科紫金牛属植物朱砂根或红凉伞的根。其味苦、辛、性凉，具清热解毒，散瘀止痛，祛风除湿之功效，主治咽喉肿痛，扁桃体炎，心胃气痛，劳伤吐血，跌打损伤，风湿骨痛［1］。

朱砂根中含有三萜、酚、醌、强心苷、有机酸和黄酮类化合物［2］。研究多集中在朱砂根挥发性成分［3］。药理学研究发现朱砂根具有止咳平喘，驱虫和杀虫［4］，抗炎抑菌、抗病毒［5］，抑制肿瘤生长等多种药理作用［6，7］。Mi-BoKim［8］等的研究表明朱砂根水提物清除自由基的能力用抗坏血酸当量表示为2.01±0.03(mmol/g)，40%乙醇提取物用Trolox当量表示为9.45±0.15(mmol/g)。但未见朱砂根不同溶剂萃取部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性的研究报道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

朱砂根于2007年10月采集于贵州省都匀地区。经贵阳中医学院刘凡教授鉴定为紫金牛科紫金牛属植物朱砂根(Ardisia crenata)，标本存于河南大学中药研究所。

α-葡萄糖苷酶 (α-glucosidase，EC 3.2.1.20); 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-N-trophenyl-α-D-glucopy ranoside，PNPG，026K1516);对硝基苯酚(4-Nitrophenol，PNP，10116387);阿卡波糖 (Acarbose，Lot 16869)和二甲亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司。DPPH(日本东京化成工业株式会社);Fe3+-三吡啶三哑嗪(tripyridyl-triazine，TPTZ;比利时Acros organics公司);［2，2'-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐］(ABTS，美国Fluka公司);6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸 (Trolox，美国Aldrich公司);丁基羟基茴香醚(BHA，比利时Acros organics公司);二丁基羟基甲苯 (BHT，比利时Acros organics公司)。

1.2 主要仪器

Multiskan MK3酶标仪 (美国Thermo Electron公司);LRH-150恒温培养箱(上海一恒科技有限公司);DELTA 320型PH计 (美国Mettler-Toledo公司);电子天平(美国Mettler-Toledo公司);旋转蒸发仪(德国Heidolph公司);UV-2000型紫外可见分光光度计(上海尤尼科仪器有限公司)。

1.3 朱砂根活性成分的提取

朱砂根干燥、粉碎后，用甲醇室温下浸泡3次，每次4 d。合并提取液后浓缩，浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到朱砂根石油醚(ACPE)、乙酸乙酯(ACEA)和朱砂根正丁醇(ACBU)部位。提取率分别为 0.98%、1.14% 和0.65%。

1.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性的筛选方法

利用本课题组建立的方法［9］。配制一系列对半稀释的朱砂根提取物浓度的样品，反应体系为8 μL一定浓度的样品，加入112 μL磷酸钾缓冲液(pH 6.8)，再加入20 μL 0.2 U/mL α-glucosidase，37℃恒温15 min后加入2.5 mmol/LPNPG 20 μL，37℃恒温反应15 min。再加入80 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液，于405 nm波长下测OD值。计算抑制率，并用origin软件求出相应IC50值。样品对α-葡萄糖苷酶抑制率的计算公式为:I% =［(Acontrol-Asample)/Acontrol］ ×100%。

1.5 抗氧化活性测定方法

1.5.1 DPPH方法

按照文献［10］，将样品和阳性对照品用甲醇配制成浓度为2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625 mg/mL，取0.1 mL样品和阳性对照品加入3.5 mL DPPH甲醇溶液(0.06 mmol/L)，混合30 min后测定515 nm处吸光度。每份样品和阳性对照品平行操作3次，取平均值，计算出清除率，并计算出半数抑制率IC50值。样品对DPPH自由基清除率的计算公式为:I% = ［(Acontrol-Asample)/Acontrol］ ×100%。

1.5.2 ABTS方法

按照文献［11］，配制ABTS自由基工作液。将样品和阳性对照品用甲醇配制成浓度为2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625 mg/mL，取0.15 mL样品和阳性对照品加入2.85 mL ABTS自由基工作液，混合，放置10 min后，在734 nm处测定吸光度。每份样品和阳性对照品平行操作3次，取平均值，计算出清除率，并计算出半数抑制率IC50值。样品对ABTS自由基清除率的计算公式为:I% =［(Acontrol-Asample)/Acontrol］ ×100%。

1.5.3 FRAP方法

按照文献［12］，将样品用甲醇和阳性对照品配制成浓度为2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625 mg/mL，取0.2 mL样品和阳性对照品加入3.8 mL新鲜配制的TPTZ工作液，混匀后37℃反应30 min后测定593 nm处吸光度，每份样品和阳性对照品平行操作3次。取平均值，计算出清除率，结果以Trolox当量表示，即每克样品的自由基清除能力相当于Trolox的自由基清除能力的微摩尔数(单位为μmol/g)。

1.5.4 半数清除率的计算

半数清除率(IC50)指清除率为50%时所需抗氧化剂的浓度，根据不同浓度抗氧化剂的清除率作曲线求出。

2 结果与讨论

2.1 朱砂根提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

在相同浓度下，朱砂根3个部位对α-葡萄糖苷酶抑制活性从大到小依次为乙酸乙酯部位(IC50= 75.62 μg/mL)＞正丁醇部位(IC50=76.92 μg/mL)＞石油醚部位(IC50=89.85 μg/mL)，均远大于阳性对照药Acarbose(IC50=1081.27 μg/mL)，从提取率和抑制活性大小两方面考虑，乙酸乙酯提取物最适合开发成α-葡萄糖苷酶抑制剂。

图1 朱砂根不同提取部位质量浓度对α-葡萄糖苷酶活性的影响。Fig.1 The mass concentration of the different extracts of A.crenata effect on α-glucosidase inhibitory activity

图1显示，朱砂根不同部位对α-葡萄糖苷酶抑制活性均呈剂量依赖性，而且，当抑制率达到一定程度时，再增加部位质量浓度，抑制活性不再增加。朱砂根乙酸乙酯部位和石油醚部位在质量浓度为187.5 μg/mL时其对α-葡萄糖苷酶抑制率达到最高值，再增加浓度其抑制率不再增加，而正丁醇部位在质量浓度为187.50 μg/mL时其对α-葡萄糖苷酶的抑制率达到81.38%，随后浓度增加抑制率略有下降，说明正丁醇部位对α-葡萄糖苷酶抑制作用已达到饱和。

2.2 朱砂根抗氧化活性

2.2.1 对DPPH自由基的清除作用

由表1看出，朱砂根的乙酸乙酯和正丁醇部位均有清除DPPH自由基的作用，其中乙酸乙酯部位清除DPPH自由基的能力最强 (IC50=38.55 mg/ L)，比阳性对照BHT(IC50=18.92 mg/L)低约1/ 2，其次是正丁醇部位。但两者均小于阳性对照BHA，且均约为其清除能力的1/13，石油醚部位在表2中未列出。在对朱砂根石油醚部位进行DPPH自由基清除能力的初筛中，测定朱砂根石油醚部位质量浓度在55.56 mg/L时，清除率为50.55%。

表1说明，朱砂根3个部位和阳性对照BHA、BHT对DPPH自由基的清除能力顺序为:BHA＞BHT＞ACEA＞ACBU＞ACPE。

2.2.2 对ABTS自由基的清除

表2显示，朱砂根乙酸乙酯和石油醚部位对ABTS自由基的清除能力较强(IC50=3.60 mg/L和3.61 mg/L)，超过阳性对照BHT(IC50=7.44 mg/ L)的清除能力，均约为BHT作用的2倍，比BHA( IC50=1.74 mg/L)的作用弱，约为BHA作用的1/ 2。朱砂根3个部位和阳性对照BHA、BHT对ABTS自由基的清除能力顺序为:BHA＞ACEA＞ACPE＞BHT＞ACBU。

表1 朱砂根不同提取部位的抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of the different extracts of Ardisia crenata

2.2.3 对Fe3+的还原能力

表2显示，朱砂根乙酸乙酯部位(FRAP=512.99±6.80 μmol TE/g)还原Fe3+的能力最高，接近阳性对照BHT(FRAP=1581.68±97.41 μmol TE /g)作用的1/3，其次为石油醚部位(FRAP=447.65 ±6.41 μmol TE/g)，约为BHT(FRAP=1581.68 ±97.41 μmol TE/g)的1/4，正丁醇部位(FRAP= 295.12±4.45 μmol TE/g)还原Fe3+的能力最低，约为阳性对照BHT(FRAP=1581.68±97.41 μmol TE/g)作用的1/19。3个部位还原Fe3+的能力均低于阳性对照BHA(FRAP=6633.04±114.04 μmol TE/g)。

朱砂根3个部位和阳性对照BHA、BHT对Fe3+的还原能力顺序为:BHA＞BHT＞ACEA＞ACPE＞ACBU。

3 结论

本文首次发现朱砂根具有α-糖苷酶抑制活性，同时评价了其不同溶剂萃取部位的抗氧化活性，其中，乙酸乙酯部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性最好，并且提取率相对较高，因此具有非常好的开发价值。

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