能量代谢途径相关基因变异与肿瘤细胞适应性进化

刘 佳, 孔庆鹏

(中国科学院昆明动物研究所 遗传资源与进化国家重点实验室, 云南昆明 650223)

肿瘤是机体在各种致癌因素作用下, 局部组织的某个或某些细胞失去生长增殖的正常调控, 导致其克隆性异常增生而形成的赘生物 (Fialkow,1979)。肿瘤组织较正常组织代谢旺盛, 尤以恶性肿瘤更为明显。在有氧条件下, 正常细胞一般通过线粒体呼吸链的氧化磷酸化来获取能量, 而在缺氧时则主要依赖糖酵解。而肿瘤细胞即使在有氧条件下,也主要通过糖酵解获取能量, 因此称为“有氧糖酵解”(aerobic glycolysis)。由于该异常现象是德国生理学家Otto Warburg首次在肿瘤细胞中所发现, 因此也被称为“Warburg效应” (Warburg, 1956; Warburg et al, 1927; Warburn & Dickens, 1931), 并在随后几十年的肿瘤研究中被广泛证实。

正常细胞的产能方式主要有两种, 分别在有氧和无氧条件下进行。无论何种方式, 每分子葡萄糖都要先进入糖酵解途径经过一系列生化反应后生成2分子丙酮酸、2分子ATP以及2分子NADH。在有氧条件下, 丙酮酸在丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex, PDHC)的作用下生成乙酰辅酶 A(Acetyl-CoA), 进入线粒体中进行三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA cycle), 产生6分子的NADH和2分子的FADH2。通过糖酵解和TCA循环, 其中产生的NADH和FADH2在线粒体内膜上的呼吸链复合体上完成电子传递的过程, 最后共生成34～36分子的ATP。糖酵解产物丙酮酸经过这种途径(糖酵解+TCA 循环)后可以充分的氧化分解营养物质, 使葡萄糖的利用率达到最优(1分子葡萄糖完全氧化可以生成 36～38分子的ATP)。在缺氧条件下, 丙酮酸在乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH)的作用下生成2分子乳酸和2分子 ATP, 明显少于有氧条件下氧化磷酸化产生的ATP数量。而在肿瘤细胞中糖酵解产物丙酮酸即使在有氧条件下也主要生成乳酸而几乎不进入 TCA循环。肿瘤细胞的快速增殖本应该需要更多的能量支持, 可产能效率并不高的糖酵解途径却是其主要产能方式, 这种能量代谢方式的转变对于肿瘤细胞的增殖究竟起到了何种作用？鉴于能量产生是细胞生存及增殖所必须, 对该问题的研究探索有助于人们深入理解并诠释肿瘤细胞的发生及发展机制。

早在 1976年就有人提出可以从进化视角对肿瘤细胞的发展进程进行研究 (Nowell, 1976), 这是因为肿瘤组织可以被看作是通过单克隆起源方式而形成的细胞群体 (Fialkow, 1979; Nowell, 1976)。因此, 肿瘤细胞群满足广义群体遗传学中的“群体”概念, 从而可以利用群体遗传学和分子进化的研究策略来研究肿瘤的发生发展过程。事实上, 后期研究确实证实了肿瘤的形成遵循体进化(somatic evolution)规律 (Crespi & Summers, 2005; Little,2010), 进一步提示从分子进化视角结合群体遗传学手段研究肿瘤细胞演化规律及其机制的可行性,而近年来测序技术的进步及大量肿瘤基因组数据的涌现更使得该研究成为可能。

1 能量代谢方式的转换是肿瘤细胞有效适应微环境改变的基础

肿瘤细胞的能量代谢主要依赖于有氧糖酵解，而不像正常细胞那样采取氧化磷酸化来获取能量,这种能量代谢的转换是肿瘤细胞最显著的十大特征之一 (Hanahan & Weinberg, 2011)。从能量需求和产能效率方面来看, 该转变对于肿瘤细胞的生存似乎不合理, 因为肿瘤细胞需要更多的能量来满足其快速增殖的需求, 而糖酵解却要消耗 18倍的葡萄糖才能与线粒体氧化磷酸化产生相同的能量。但如果考虑到肿瘤细胞的微环境, 这样的转变则并非没有理由。事实上, 在肿瘤细胞快速增殖过程中, 原有的血管数量已经不能满足肿瘤自身生长的需要,氧气供应严重不足, 而在缺氧条件下, 糖酵解却能快速生成细胞增殖所需要的能量。与此同时, 糖酵解途径促使大量代谢中间产物进入核苷酸和氨基酸生成等多种生物合成途径, 产生的生物大分子亦是细胞器合成所必需, 有利于新生细胞的组装(Vander Heiden et al, 2009)。近年来的研究发现,这种能量代谢的转换并非肿瘤细胞所特有, 而几乎是所有快速增殖细胞的一个共性, 提示能量代谢方式的转换是快速增殖细胞, 尤其是肿瘤细胞有效适应微环境改变的基础 (Vander Heiden et al,2009)。

有趣的是, 肿瘤细胞周边存在的缺氧微环境会激活缺氧诱导因子(HIF)蛋白家族并上调葡糖转运蛋白和糖酵解途径的多种酶活性, 从而加剧对糖酵解的利用 (Bartrons & Caro, 2007), 直到血管生成后能够提供足够的氧气。而之后细胞又进入加速分裂时期再次导致缺氧, 这样的恶性循环致使肿瘤细胞越长越大, 甚至产生侵袭能力 (Cui et al, 2012)。因此, 那些能够使肿瘤细胞获得增殖优势、逃避机体免疫监控或减少凋亡的突变, 都可能在其快速增殖过程中得以选择性保留并在细胞群体中得以固定 (Crespi & Summers, 2006)。

2 肿瘤细胞中能量代谢方式发生转变的可能原因

如前所述, 肿瘤细胞中能量获取途径发生了明显的转变, 主要靠糖酵解来产能。随着研究的深入,人们逐渐发现肿瘤细胞与正常细胞相比确实发生了很多生理改变, 如, 线粒体氧化磷酸化功能障碍(Lemarie & Grimm, 2011)以及细胞代谢酶谱改变(Moreno-Sánchez et al, 2007; Weinhouse, 1976)等。这些蛋白功能或表达的变化在基因水平的表现如何？随着测序技术的发展, 在肿瘤细胞基因(组)上检测到的大量突变, 为肿瘤能量代谢方式转变机制的研究提供了更多的信息。

2.1 细胞有氧呼吸途径功能损伤

早期的研究认为肿瘤细胞能量代谢的改变, 可能是由有氧呼吸功能损伤所造成。肿瘤细胞快速增殖扩张的过程需要消耗大量的能量, 而线粒体在细胞能量代谢、氧自由基产生甚至细胞凋亡中都起着重要作用 (DiMauro & Schon, 2003), 因此人们推测线粒体在肿瘤发生过程中可能扮演着重要的角色。特别是线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA)编码了呼吸链上 13个重要的氧化磷酸化蛋白, 其突变率远高于核DNA, 并具有缺乏重组、高拷贝数等特点, 这都使得 mtDNA与肿瘤的相关性受到广泛关注。而近20年的相关研究也发现, 几乎所有肿瘤中都存在 mtDNA体细胞突变(somatic mutation)(Brandon et al, 2006; Chandra & Singh, 2011;Chatterjee et al, 2006; Kulawiec et al, 2010) (表 1)。

表1 已报道的具有mtDNA体细胞突变的肿瘤类型 (引自Liu et al, 2012)Tab. 1 Reported tumor types with mtDNA somatic mutations (Cited from Liu et al, 2012)

核基因编码的呼吸链复合体蛋白也存在体细胞突变(主要发生在复合体 II的 SDHA, SDHB,SDHC, SDHD及SDHAF2基因), 且该突变会造成线粒体呼吸链损伤从而影响氧化磷酸化功能, 阻碍ATP生成, 而这也被认为可能是致使肿瘤细胞产能途径逐渐转向糖酵解的一个原因 (Bardella et al,2011; Lemarie & Grimm, 2011)。Namslauer &Brzezinski (2009)发现线粒体细胞色素B（呼吸链复合体IV的核心酶)第125位上的甘氨酸突变为天冬氨酸后会显著减弱该亚基的酶活(～30%), 从而降低线粒体呼吸链能量转换的效率, 进而导致复合体IV的质子泄漏以及线粒体内电化学梯度的不平衡,最终影响肿瘤生长。

作为TCA循环催化酶的异柠檬酸脱氢酶(IDH),其编码基因在肿瘤细胞中也存在一些能够影响IDH功能的体细胞突变。正常情况下, IDH催化异柠檬酸生成 α酮戊二酸(α-KG), 且 TCA循环呈环状反应。当IDH突变后, 异柠檬酸不能生成α-KG, 循环中断, 而谷氨酰胺酶 2(GLS2)活性增加, 促进谷氨酰胺生成α-KG以补充TCA循环中α-KG的不足,使TCA成为线性反应。反应在柠檬酸终止时, 大量堆积的柠檬酸可用于合成脂类。IDH的这种失去功能的突变也导致细胞内大量的TCA中间产物堆积,非常有利于生物大分子的合成。另外, IDH1和IDH2特定氨基酸位点的突变可使其获得新的酶活性, 这些突变在神经胶质瘤和急性骨髓性白血病中非常常见, 如IDH1蛋白的132位氨基酸以及IDH2蛋白的172和140位氨基酸的突变, 使得IDH获得新活性, 可将 α-KG 转化成羟戊二酸(2-HG)并消耗NAPDH (Dang et al, 2010; Gross et al, 2010; Sellner et al, 2010; Ward et al, 2010)。而这些产生2-HG的IDH突变可以通过抑制组蛋白甲基化, 对肿瘤细胞全基因组水平的甲基化进行调控, 从而进一步调控细胞分化 (Duncan et al, 2012; Lu et al, 2012)。在神经胶质瘤中, IDH1 132位氨基酸由精氨酸到组氨酸的突变＞90%, 而在急性骨髓性白血病、黑素瘤及前列腺癌中也都发现有 IDH1和 IDH2的突变(Ghiam et al, 2012; Lian et al, 2012; Sellner et al,2010; Ward et al, 2010; Yan et al, 2009)。IDH的这些突变在肿瘤细胞适应其微环境中发挥重要作用, 可使 TCA循环中间产物如柠檬酸、乙酰辅酶 A及NADH/FADH2大量积累、ATP产生迅速增加并为新生细胞提供足够的生物大分子及养料。尽管如此,这些研究仍未能澄清编码呼吸链复合体核基因的突变与肿瘤细胞能量代谢方式转换的因果关系。

2.2 肿瘤细胞代谢酶谱发生改变

近些年来肿瘤细胞酶谱的改变在许多研究中被证实, 例如, 研究发现癌基因(如 AKT, c-Myc,ErbB2及 RAS等)和抑癌基因(如 PTEN及 P53等)的异常表达均可增加糖酵解酶活性或/和抑制三羧酸循环酶活性, 导致肿瘤细胞代谢重新编程 (Hsu& Sabatini, 2008; Jiang et al, 2011; Koppenol et al,2011; Kroemer & Pouyssegur, 2008)。Fantin et al(2006)发现肿瘤细胞中呼吸链并未损伤, 而是其糖酵解通路中乳酸脱氢酶(催化丙酮酸到乳酸的反应)活性显著增加, 使得肿瘤细胞倾向于使用糖酵解供能。Cai et al (2010)的研究发现抑制乳酸脱氢酶活性,刺激丙酮酸脱氢酶活性(催化丙酮酸到乙酰Co-A的反应), 可以有效的增强呼吸链氧化磷酸化作用, 抑制肿瘤细胞生长。

肿瘤细胞中有氧糖酵解的产生与原癌基因的激活(获得功能)以及抑癌基因的突变(丧失功能)有着密切的关系。原癌基因和抑癌基因在维持正常细胞生理功能过程中均具有关键的调控作用, 它们的改变对细胞代谢有着深刻的影响, 实际上几乎在所有的肿瘤细胞中均能找到原癌基因或抑癌基因突变的印记。

正常细胞主要的三条葡萄糖代谢途径均受到 P53的严格调控(图 1)：(1) 葡萄糖通过糖酵解途径生成 ATP和乳酸; (2) 葡萄糖通过戊糖磷酸途径生成核糖 5磷酸和 NAPDH; (3) 葡萄糖通过糖酵解生成丙酮酸后生成乙酰辅酶 A进入线粒体 TCA循环。在葡萄糖氧化途径中衍生的柠檬酸进入细胞质后加工成乙酰辅酶A用于脂类合成, 草酰乙酸用于氨基酸以及α-KG合成。首先, P53可抑制糖酵解效率, 通过抑制葡糖转运蛋白(GLUT)降低细胞对葡萄糖的摄入 (Hu et al, 2010), 抑制磷酸变位酶(PGM)以控制糖酵解速率, 并且诱导TIGAR(TP53诱导的糖酵解和凋亡调节蛋白)转录,TIGAR抑制磷酸果糖激酶2(PFK2)降低细胞内果糖2, 6二磷酸水平 (Bensaad et al, 2006), 进而降低糖酵解水平。其次, P53抑制葡糖 6磷酸脱氢酶(G6PDH)活性, 降低戊糖磷酸途径效率。再者, P53促进细胞色素 C氧化酶 2(SCO2)和谷氨酰胺酶2(GLS2)以促进线粒体氧化磷酸化效率 (Assaily &Benchimol, 2006)。

图1 P53在能量代谢通路中的作用Fig. 1 The role of P53 in energy metabolism pathway缩写及英文释义(abbreviations)：Glucose 葡萄糖; Glucose-6-p 葡萄糖6磷酸; Fructose-6-p 果糖6磷酸; Fructose-2,6-biP/ Fructose-2,6-biphosphate 果糖2, 6二磷酸; Pyruvate 丙酮酸; Lactate 乳酸; Ribosome-5- phosphate 核糖5磷酸; Acetyl-CoA 乙酰辅酶A; Citrate 柠檬酸; α–KG α酮戊二酸; Glutamine 谷氨酰胺; Glutamate 谷氨酸; GLUT 葡萄糖转运蛋白; TIGAR TP53诱导的糖酵解和凋亡调节蛋白; PFK1 磷酸果糖激酶1; PFK2 磷酸果糖激酶2; PGM 磷酸变位酶; LDH乳酸脱氢酶; PDHC 丙酮酸脱氢酶复合体; Glycolysis 糖酵解; PPP 戊糖磷酸途径; Glutaminolysis 谷氨酰胺代谢; OXPHOS 氧化磷酸化。

P53除通过以上几种方式直接作用于能量代谢通路,在正常细胞中抑制有氧糖酵解的产生外, 还能够通过影响多个信号通路的复杂网状系统调控细胞代谢 (Cairns et al, 2011)。P53下游的四个抑癌基因PTEN、IGF-BP3、TSC2以及 AMPK均可抑制PI3K/AKT和mTOR通路活性, 减缓细胞生长并逆转细胞的肿瘤表型 (Feng & Levine, 2010)。同时肝激酶 LKB1也可通过 AMPK抑制 mTOR活性(Shackelford & Shaw, 2009)。除了减缓细胞生长, 依赖P53抑制的mTOR还可促进细胞自噬, 起到防止肿瘤发生的作用 (Feng & Levine, 2010)。

人类肿瘤中P53突变为～50%, 其失活使得原先受到严格调控的网络系统发生动摇, 致使很多能量代谢相关酶的表达量发生变化 (Cairns et al,2011)。P53突变可使GLUT表达显著增加, 葡萄糖大量进入细胞 (Hu et al, 2010), TIGAR转录受到抑制, 造成PFK2活性增加, 糖酵解效率显著增加, 大量丙酮酸生成乳酸和ATP (Jiang et al, 2011), 这时ATP的生产要比线粒体氧化磷酸化迅速得多, 这就满足了增殖细胞对能量的快速需求。与此同时, 糖酵解过量导致中间代谢产物堆积, 葡糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸都可进入戊糖磷酸途径, 其产物 NADPH和核糖5磷酸的产量大大增加。其中, 核糖5磷酸用于合成核苷酸, NAPDH是细胞内维持氧化还原水平的重要因子, 同时线粒体的氧化磷酸化受到抑制, 产能依赖糖酵解 (Jiang et al, 2011)。因此, 当P53发生突变失活后, 细胞内这些严格控制的平衡(内稳态)就会被打破, 细胞发生代谢转变, 这也是导致能量代谢途径发生转换的关键。除了 P53, 其它一些癌基因(如RAS及MYC等) (Gao et al, 2009;Shim et al, 1997; Yun et al, 2009)或抑癌基因(如VHL及mTOR等) (Kaelin, 2002; Zoncu et al, 2011)也可通过类似途径作用于细胞内单个或多个信号通路来调控代谢。有意思的是, 这些基因有一个共同的特点, 即其调控范围非常广泛, 这可能也就是为什么在人体正常细胞中这些基因要比其它基因受到更强的纯净化选择作用 (Thomas et al, 2003)。那些对肿瘤细胞的生长增殖具有明显优势的癌基因或抑癌基因突变, 在肿瘤细胞克隆增殖过程中可能被选择性保留下来, 不断促进肿瘤细胞的生长增殖(Crespi & Summers, 2005, 2006)。

3 基于进化视角研究肿瘤细胞能量代谢方式的转变机制

肿瘤通过单克隆方式起源, 且遵循体进化模式,因此通过分子进化的角度来研究肿瘤细胞的发生及发展, 可更深刻地理解能量生产转换对其在体内对微环境适应的重要作用。具体而言, 肿瘤细胞具有的大量体细胞突变、表观遗传改变以及基因组不稳定性, 为其快速进化提供了不可或缺的原材料。肿瘤细胞在其克隆性增殖的过程中, 不仅要快速适应微环境（例如缺氧）的激烈改变, 更要与正常细胞争夺有限的营养物质。而糖酵解可以不需耗氧就能快速产生 ATP, 并提供给细胞大量的用于新细胞合成的生物大分子, 这很可能是肿瘤细胞在快速增殖过程中有效应对缺氧微环境并实现对营养物质竞争优势的重要方式 (Vander Heiden et al, 2009)。当然, 那些能够使肿瘤细胞获得生存优势(细胞快速增殖、能量生产快、需氧量小、逃避衰老和凋亡、逃避机体免疫细胞捕杀以及更快的吸收与利用营养物质)的基因突变或表观遗传改变等都可通过正选择作用迅速在细胞群体中固定下来, 使肿瘤细胞在氧气及养料非常匮乏的微环境中也能快速增殖(Crespi & Summers, 2005, 2006)。

目前在肿瘤mtDNA上发现的大量体细胞突变频率远大于核基因, 但这些突变对肿瘤发生的作用未能达成共识。一种观点认为, 这些突变很可能导致肿瘤细胞线粒体呼吸链功能出现障碍, 进而促使肿瘤细胞采用糖酵解来提供能量。功能实验也证实,一些mtDNA突变的确会导致线粒体氧化磷酸化水平或活性氧(reactive oxygen species, ROS)产量发生改变 (Gómez-Durán et al, 2010; Moreno-Loshuertos et al, 2006)。但这仍未能澄清“mtDNA突变究竟是肿瘤细胞能量代谢方式发生转换的原因还是结果”这一根本问题。而另一种观点则认为, mtDNA突变的发生很可能只是一种能量代谢方式转换的副产品。因为肿瘤细胞主要通过糖酵解而非线粒体氧化磷酸化来获取能量, 伴随有氧代谢通路在肿瘤细胞中的作用降低, 其受到的功能限制(functional constraints)减弱, 从而导致其相关基因(尤其是突变速率很快的 mtDNA)更容易发生突变 (Liu et al,2012)。

基于这两种对立的观点, 从分子进化视角进行研究或许能有助于澄清该问题。近期, Zhidkov et al(2009)的研究发现肿瘤细胞mtDNA的体细胞突变并非随机分布于线粒体基因组, 而是与人类群体中mtDNA单倍型类群（haplogroup, 即来自最近共同祖先的所有单倍型的集合, 其主要特征为共享多个突变）的突变模式（motif）非常相似, 因此推测这种模式的形成是由于肿瘤中的mtDNA受到类似于正选择(positive selection)作用, 且有利于肿瘤细胞对微环境的适应。然而该观点并未得到随后研究的证实, 相反,这些研究显示肿瘤细胞mtDNA并未受到正选择作用, 而很可能是经受了选择压力放松(relaxation of purify selection) (Liu et al, 2012;Stafford & Chen-Quin, 2010)。我们进一步的分析显示, 该矛盾是由于Zhidkov et al (2009)研究中所引用的数据质量所致 (Liu et al, 2012)。通过对广泛收集的已发表的各种肿瘤mtDNA全序1 054条与3639条来自一般人群的线粒体全基因组序列比较后发现, 两者受到的选择压力存在着明显差异。其中,肿瘤mtDNA突变中非同义突变/同义突变 [number of nonsynonymous substitution/number of synonymous substitution (N/S)] 的比值显著高于一般人群, 肿瘤mtDNA体细胞突变在线粒体基因组上呈现一种接近完全随机的分布模式(图 2)。该结果进一步表明,肿瘤mtDNA的突变模式更可能是选择压力放松的结果, 且该现象在不同类型肿瘤中几乎一致 (Liu et al, 2012)。显然, 导致该现象出现的主要原因很可能就是由于肿瘤细胞能量代谢方式的转变, 使得有利于细胞快速产能并大量生产生物大分子的糖酵解途径作用增强, 而高耗氧且产能速率低的(尽管效率很高)有氧呼吸途径功能则发生降低, 而此作用在突变速率较高的mtDNA上表现得尤为明显。

肿瘤细胞 mtDNA的研究提示, 发生于呼吸链编码基因的突变对于肿瘤细胞来说很可能只是肿瘤细胞能量代谢方式转换的结果。但是否是由于细胞代谢酶谱的改变在这个转变中起着更重要的作用, 还需要更全面深入的研究。显然, 从进化视角将有助于更好地理解基因变异在肿瘤发生发展中的作用, 也对肿瘤的基因靶向治疗提供更为准确的依据。

4 小结

图2 癌症线粒体DNA体细胞突变分布模式图(引自Liu et al, 2012)Fig. 2 Distribution of the observed cancerous mtDNA somatic mutations (Cited from Liu et al, 2012)每个圆圈表示一个突变（Each circle represents one mutation in the corresponding region of mtDNA）。

肿瘤细胞对糖酵解途径的依赖, 不但能够满足其快速生长及增殖过程中的大量能量需求, 同时还能提供细胞合成的生物大分子物质。因此, 肿瘤细胞能量代谢途径的转变(有氧呼吸→糖酵解)很可能是肿瘤细胞有效适应缺氧等微环境剧变并满足快速增殖需求的一个主要原因。然而, 在肿瘤细胞能量代谢途径的转变过程中, 目前尚不完全清楚到底是哪些遗传变化起到了至关重要的推动作用(driver), 而哪些变异仅仅是由于功能转变而产生的结果(passenger)。尽管之前的研究提示, 肿瘤细胞中发现的绝大部分mtDNA体细胞突变很可能都只是其能量代谢方式转换的结果 (Liu et al, 2012)。但鉴于mtDNA仅编码线粒体氧化磷酸化复合体中的13个蛋白, 而能量代谢途径(包括糖酵解、TCA循环和氧化磷酸化等)其他相关蛋白均由核 DNA(nDNA)所编码, 进一步解析能量代谢途径相关核基因的突变模式将是诠释其能量代谢方式转变可能机制的关键环节。而从分子进化的角度, 开展肿瘤细胞能量代谢相关基因（mtDNA和nDNA）的突变模式及其选择压力等分析, 通过揭示可能存在的肿瘤细胞适应性进化的遗传印记, 澄清相关遗传变化在能量代谢方式改变(有氧呼吸→糖酵解)过程中的作用,将为诠释肿瘤细胞产能方式的转变机制及深入理解肿瘤的发生机制提供新的视角和证据。