哺乳动物卵巢生殖干细胞研究的现状与未来

李朝晖, 郭 琨, 郑 萍

(中国科学院昆明动物研究所 遗传资源与进化国家重点实验室, 云南 昆明 650223)

无脊椎动物(如果蝇)和低等脊椎动物(如鸟类和鱼类)的卵巢内存在卵巢生殖干细胞, 生殖干细胞可以持续进行自我更新和分化从而形成新的卵细胞, 这个现象称为卵细胞的从头发生或再生(neo-oogenesis) (Pearl, 1917; Draper et al, 2007;Kirilly & Xie，2007)。雄性哺乳动物也存在精原干细胞维持精子的持续发生。但雌性哺乳动物卵巢内是否存在生殖干细胞及雌性配子的再生却备受争议(Vermande-Van Eck, 1956; Gosden, 1975; Gosden,2004; Telfer, 2004)。虽然一个世纪前就存在反对和支持的观点, 但由于未能获得充分的证据支持哺乳动物雌性配子的再生, 1951年美国科学家Zuckerman发表了一篇总结性论文, 指出哺乳动物雌性配子的发生仅出现于胚胎发育期, 哺乳动物出生后卵巢中生殖细胞已经发育到了原始卵泡阶段(此时生殖细胞被一层鳞片状的体细胞包围), 并停留在第一次减数分裂前期的双线期, 之后这些卵泡或者凋亡或者在休眠一段时间后重新启动发育。因此, 哺乳动物出生后没有卵子的再生(neo-oogenesis)(Green & Zuckerman，1951)。自 20世纪50年代始, 以Zuckerman的结论为主, 在当时较多学者的证据支持下, 形成了哺乳动物卵巢“固定卵泡库”的理论, 这一理论雄踞生殖生物学领域,并为教科书沿用至今。这似乎很容易解释雌性哺乳动物的卵巢功能衰退较早的自然现象。但是, 从进化生物学的角度它很难解释为什么雌性哺乳动物不利用干细胞产生新的雌性配子, 而要用含有更多遗传突变的陈旧的雌性配子繁衍后代(如人类用于生殖繁衍的卵细胞多数已存在了 20～40 a), 同时,也难以解释所观察到的一些其他现象。因此, 仍有一些生殖生物学家一直致力于哺乳动物出生后是否存在卵细胞从头发生的研究, 特别是最近 10年中, 生殖生物学家通过不同的方法和技术手段取得了一系列证据支持再生理论。本文将重点综述新兴的“再生理论”, 并提出哺乳动物卵巢生殖干细胞在研究过程中亟待解决的关键问题。

1 哺乳动物雌性配子发生的“再生理论”

支持“再生理论”的证据相当一部分来源于对卵巢卵泡数目的研究。按照传统理论, 哺乳动物出生后卵泡数目应呈减少趋势。但是, 小鼠卵巢中原始卵泡的数目在出生后相当一段时间内(如12～100 d)始终维持相对稳定, 不出现显著下降趋势（Johnson et al, 2004; Kerr et al, 2006), 且在生殖周期中还出现明显波动（Johnson et al，2005); 杀伤生殖细胞的化学药物致小鼠卵巢轻度或中度损伤后, 经过一段时间, 卵巢功能和卵泡数目可以得到一定程度的恢复(Johnson et al, 2005); 另外, 小鼠及非人灵长类动物卵巢卵泡的实际可使用时间远远超过通过数学模拟及实验观察推算出的理论卵泡凋亡频率及消耗枯竭时间(Vermande-Van Eck, 1956; Johnson et al,2004; Kerr et al, 2006)。这些现象提示, 哺乳动物卵巢中可能存在新卵泡的发生和补给。

再生理论更为直接的支持证据是能进行 DNA复制的生殖细胞的发现。按照传统的“固定卵泡”理论, 卵巢中所有的生殖细胞已发育到第一次减数分裂前期的双线期, 不可能存在进行 DNA复制的生殖细胞。2004年, Johnson et al对青年和成年小鼠的卵巢进行体内 5'-溴脱氧尿嘧啶核苷(5'-bromodexyuridine, BrdU)标记(DNA 复制能力的标记), 并结合生殖细胞特异表达的标记分子 MVH（mouse vasa homologue)的检测, 发现小鼠卵巢中的确存在能进行 DNA复制的生殖细胞（BrdU和MVH双阳性细胞)。这类细胞位于卵巢表面上皮(ovarian surface epithelia, OSE), 数量在雌性小鼠青春期后急剧下降, 出生后30 d每个卵巢中有～63个细胞, 出生后40 d每个卵巢有～6个细胞。尽管这些能进行 DNA复制的生殖细胞的身份并不确定,它们可能是正进行有丝分裂的生殖干细胞或者前体细胞, 也可能是正进行减数分裂 DNA复制的生殖细胞, 但不管是哪种情况, 发现能进行DNA复制的生殖细胞已经极大地冲击了传统理论。

既然可能存在卵细胞的重新发生, 那么能重新生成卵细胞的细胞（生殖干细胞)存在于何处, 卵巢还是其他器官。2005, Johnson et al报道将健康小鼠的骨髓（bone marrow)或血液（periphery blood) 移植到经白消安(busulfan)处理导致卵巢功能衰退的小鼠中, 可以在受体小鼠卵巢内生成卵细胞样细胞,但他们没有通过受精和胚胎发育手段进一步验证这些卵细胞样细胞是否是真正的卵细胞, 并据此推断骨髓或血液中可能存在生殖干细胞。但随后其他团队的研究证据很快否定了骨髓或者血液循环系统来源的细胞能再生出卵细胞（Eggan et al, 2006)。2009年, Niikura et al发现老年小鼠的卵巢中存在处于减数分裂前的Stra8（启动减数分裂DNA复制的必需因子)阳性生殖细胞。他们将老年小鼠卵巢组织(其中的生殖细胞已通过转基因标记了 GFP)移植到年轻小鼠卵巢中（其中的生殖细胞没有GFP标记),六周后发现受体卵巢中出现了 GFP标记的卵母细胞。该结果提示卵巢中可能存在能产生新卵母细胞的减数分裂前生殖细胞, 但这些证据并不足以支持它们是卵巢中的生殖干细胞。另外, 其他研究人员(Bukovsky et al, 2005; Virant-Klun et al, 2008)也分别从小鼠或人卵巢表皮中获得一类特殊的上皮细胞, 体外培养这些细胞可以进行分裂增殖, 它们表达Oct4、Nanog、Sox2、c-kit和SSEA4等, 并能分化形成形态上类似卵细胞的细胞(表达透明带蛋白并形成类似透明带的结构), 与颗粒细胞共培养还可形成卵泡样结构。但这些研究均未能进行功能实验, 未验证这些卵细胞样细胞是否能受精并发育形成健康的后代。由于没有功能数据的支持, 这些实验缺乏说服力。

直到2009年, 上海交通大学Zou et al获得了功能证据支持卵巢中存在生殖干细胞的假说。他们从新生及成年小鼠的卵巢中分离出了一类生殖细胞,直径为 15～20 μm, 这些生殖细胞能在特定的体外培养条件下分裂增殖, 具备高端粒酶活性, 表达生殖细胞的特异标记分子 MVH, 也表达某些胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)和原始生殖细胞(primordial germ cell, PGC)特异表达的基因(如Oct4、Dazl、SSEA1及 Blimp-1等), 但不表达减数分裂标记基因和卵母细胞表达的基因(如 Figla和ZP3)。短期或长期扩增后移植到经药物处理的不育小鼠卵巢内能使其恢复生殖力 (Zou et al, 2011)。White et al (2012)基于流式分选的方法重复了Zou et al在小鼠上的实验, 证实了小鼠卵巢中的确存在这样一类生殖细胞, 它们可以在体外培养条件下增殖, 移植到卵巢中可以再生出正常卵细胞, 这些卵细胞能成功地进行体外受精并在体外发育形成囊胚(blastosphere)。更为震惊的是, 他们从成年女性的卵巢皮层组织中也分离到了类似的细胞, 并在体外成功进行了扩增培养, 这些细胞在分化条件下能自发形成35～50 μm的卵细胞样细胞, 用GFP标记后注射到人卵巢皮质活体组织, 再移植到免疫缺陷鼠内, 可产生GFP阳性的卵母细胞。但由于伦理限制,这些卵细胞是否具备功能尚不清楚。这一研究不仅重复和证实了Zou et al在小鼠中的研究结果, 并指出人类卵巢中也存在类似的生殖干细胞。当然, 迄今为止还没有更多的实验室能稳定重复出Zou et al和White et al的研究结果, 其真实可信性还需要更多实验室的独立工作进行验证。这些先锋实验工作的低重复性也反映了我们对这类细胞的特性仍知之甚少, 由此可导致实验结果具很大的不确定性和不稳定性。

2 哺乳动物雌性配子发生的“固定卵泡理论”

尽管近年越来越多的证据表明哺乳动物卵巢内很可能存在生殖干细胞, 但不同的研究人员采取相似的方法却得到了不一致的结果。例如, 2006年(Bristol-Gould et al, 2006)通过数学建模的方式对卵巢卵泡数目进行分析, 推算得出哺乳动物终身排出的卵的数目与出生时卵巢中卵子的数目相等的结论, 进而支持经典理论; Liu et al (2007)通过对成年女性卵巢中的生殖细胞进行增殖和减数分裂的标记基因表达检测分析, 认为不存在生殖细胞的更新或卵母细胞的生成。

Begum et al (2008)进行了小鼠卵巢的移植实验,并未发现卵巢中存在具再生能力的生殖细胞。这些结论上的差异可能来源于不同实验室采用的具体检测方法的细致性和灵敏性差异。例如Liu et al在他们的研究中并没有检测到表达NOBOX的生殖细胞, 而 NOBOX在成人卵巢中初级卵泡、次级卵泡中都应该有表达（Huntriss et al, 2006)。这表明Liu et al所用的方法对于检测表达量很少的蛋白并不灵敏和适用（Zhang et al, 2008)。

Zhang et al (2012)因质疑Zou et al和White et al使用细胞质蛋白MVH 来分离和纯化表达MVH 的生殖干细胞样细胞的可行性和准确性, 采用Rosa26 rbw/+Ddx4-Cre的转基因小鼠进行了系列研究。通过注射外源带荧光标记的胚胎期12.5 d的卵巢细胞(包括体细胞和原始生殖细胞)到正常或受损成体卵巢中, 观察是否有嵌合体卵泡形成从而来评判卵巢中是否存在新生卵泡的发生。由于没有观察到嵌合卵泡的生成, 他们认为卵巢中不存在卵泡的再生。另外, 他们还观察了出生后小鼠卵巢中 MVH阳性和阴性细胞的体外增殖能力及移植到卵巢中的分化能力, 发现MVH阳性的卵巢生殖细胞不能增殖,而 MVH阴性的细胞虽然能增殖形成克隆, 但不具备分化形成生殖细胞的能力。基于上述结果, 他们认为小鼠出生后卵巢中没有卵泡的再生。虽然此研究是目前支持固定卵泡理论最有力的证据之一, 但他们的工作也存在缺陷。首先, 可否将嵌合体卵泡的生成作为检测受体卵巢自身是否存在卵细胞再生活动的标准尚不确定, 再者, 成体卵巢和胚胎期卵巢的细胞在分子特征上存在区别, 它们是否能在功能上有相互作用并能形成嵌合体未见报道。

3 展 望

哺乳动物卵细胞再生理论尽管取得了上述进展, 但目前的证据仍有明显的不足之处。Zou et al和White et al的研究都采用了体外培养和移植的方法, 这些方法存在一定的缺陷, 即卵巢生殖干细胞的培养、扩增和移植是在非生理条件下进行的。一方面, 培养基中高浓度的生长因子有可能对细胞产生一定程度的重编程作用; 另一方面, 生殖干细胞移植到卵巢中, 干细胞的再生活动是在损伤的病理条件下进行。因此, 体外培养和移植的实验仍无法回答最关键的科学问题, 即生理状态下卵巢中是否真实地存在这样一类生殖干细胞, 它们是否在正常生理条件下通过增殖和分化产生新的雌性配子, 从而维持卵巢的正常功能。

与体外细胞培养和移植的研究方法比较, 体内世系追踪(in vivo lineage tracing)方法则能可靠地揭示生理状况下干细胞的活动情况, 已广泛应用于多种体内成体干细胞的研究, 如神经干细胞(Bonaguidi et al, 2011), 毛囊干细胞（Snippert et al,2010; Snippert & Clevers, 2011), 小肠干细胞(Carlone, 2009), 精原干细胞等（Nakagawa et al,2007; Nakagawa et al, 2010)。其基本原理是用荧光蛋白（如GFP)或者LacZ系统对干细胞进行永久性及无损伤性标记, 利用这些标记并结合细胞在不同分化和发育阶段的特征, 跟踪体内被标记的干细胞的命运。具体为首先需要知道研究的干细胞表达的特异标记分子, 然后利用 Cre-LoxP技术实现干细胞的标记。需要建立两类转基因工具小鼠, 一种为干细胞标记基因驱动表达Cre-ERT2转基因工具鼠,另一种为报告转基因小鼠(reporter mouse), 含Rosa26-loxp-stop-loxp-GFP/YFP/LacZ转基因位点。两种转基因工具小鼠杂交后, 干细胞特异性标记基因驱动表达无重组酶活性的 Cre-ERT2融合蛋白,不能对LoxP位点进行重组和删除。但体内注射雌激素类似物Tamoxifen或4-OH-Tamoxifen后即可诱导Cre重组酶激活, Cre随即敲除loxP位点间的翻译终止密码子, 使 GFP/YFP/LacZ报告基因持续表达, 从而永久性标记上表达标记基因的细胞, 实现对细胞命运的在体示踪 (Kretzschmar & Watt，2012)。采用体内世系追踪技术研究生理状态下卵巢中是否存在干细胞及卵细胞的再生活动, 将可能回答上述关键科学问题。但目前我们尚不知道采用何类特异性基因进行标记和示踪, 因此寻找到适合的标记及示踪因子将是在这一领域取得突破性进展的关键。在澄清生理条件下卵巢中是否存在生殖干细胞及卵细胞的再生现象以后, 继续探索和研究卵巢生殖干细胞的再生活动规律、生殖干细胞异常与卵巢功能自然衰退及病理衰退的关系, 以及卵巢生殖干细胞的调控机制, 将有助于我们更全面深入地理解卵巢功能生理性和病理性衰退的机制, 并可能推动生殖干细胞在再生医学中的应用（Bazer, 2004;Skaznik-Wikiel et al, 2007)。