朱鹮细胞系的建立及其生物学特性观察

王金焕, 苏 榕, 苏伟婷, 成 诚, 魏曙光, 丁海华, 段 英, 李生斌, 佴文惠,*

(1. 中国科学院昆明动物研究所 遗传资源与进化国家重点实验室, 云南 昆明 650223;2. 西安交通大学 法医学院, 陕西 西安 710061; 3. 国家林业总局, 陕西省林业厅, 陕西 西安 710082)

朱鹮 (Nipponia nippon)属鹳形目(Ciconiiformes)鹮科(Threskiornithidae)朱鹮属(Nipponia), 是世界级珍稀濒危物种, 国家 I级重点保护鸟类。朱鹮曾经广泛分布于日本、朝鲜半岛、中国和俄罗斯西伯利亚西南部。然而, 20世纪中叶以来, 由于环境污染、全球气候变暖、捕猎和人类活动等因素的影响, 朱鹮的数量急剧减少, 野生种群在日本、朝鲜半岛和俄罗斯的分布地区先后消失。中国自从 1964年在甘肃康县采集到一只标本后, 直到 1981年的近 20年一直没有朱鹮的报道（Ding, 2004)。1981年野生朱鹮种群(7只)在陕西洋县被重新发现（Liu, 1981)。此后, 我国在朱鹮的保护和研究方面开展了大量的工作, 主要包括朱鹮生态生物学、保护生物学、遗传学、解剖学、饲养繁殖、病理学、疾病防治以及保护管理和再引入等。由于国家的高度重视, 野生朱鹮及其栖息地得到了有效保护, 野生种群数量不断增加。同时, 朱鹮人工饲养繁殖也与野生种群的保护同步进行。1989年, 北京动物园人工繁殖朱鹮在世界上首次获得成功(Li, 1989)。随后三个朱鹮人工种群分别在北京和陕西建立, 有力保证了朱鹮种群的恢复和发展。大量的研究工作也为朱鹮的科学保护奠定了坚实的基础（Ding, 2004)。

野生动物的遗传资源保护, 除建立专门的保护机构、制定相关法律和建立国家公园、自然保护区及易地保护外, 以深低温(-196 °C)冻存动物的生殖细胞和体细胞则为另一条有效的途径(Shi, 1989)。细胞是生命的基本单位, 具有生命所有的遗传信息。动物体细胞系的建立, 为从细胞和分子水平开展各类研究提供经济、方便的材料来源, 也为以后再建当时或许已灭绝的物种提供材料储备。迄今为止, 还没有关于朱鹮体细胞成功建系的报道。对我国的朱鹮, Liu et al（1992)报道了两只饲养于北京动物园的朱鹮的染色体性别鉴定及核型分析的结果,但未见朱鹮染色体G带、C带和Ag带的报道。

本研究利用微创取样方法, 在不对朱鹮造成致命伤害的前提下, 获得其皮肤样本, 成功建立了朱鹮的体细胞系, 并对该细胞系的体外生长特征、性染色体的荧光原位杂交鉴定以及染色体G带、C带和Ag带等进行了分析。

1 材料和方法

1.1 材料来源

雌、雄两只成年朱鹮均来自陕西朱鹮人工繁殖中心。取材前彻底消毒背部皮肤, 用眼科剪剪下～0.5 cm×1 cm的一块皮肤, 迅速放入运输培养基内。动物行伤口缝合处理后放回饲养网。

1.2 细胞培养

细胞培养用运输液为含有100 U/mL青霉素钠以及100 μg/mL 链霉素的DMEM(GIBCO); 生长液为含有 10%胎牛血清的 OPTI-MEM(GIBCO), pH 7.2～7.4; 培养器皿为培养面积 25 cm2的一次性塑料培养瓶(Corning)。

1.2.1 原代细胞培养 使用含两倍双抗的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)洗涤皮肤组织块5次, 剪小至～1 mm; 加入0.25%胰酶(1:250,Amresco)0.5 mL消化0.5 min后迅速加入生长液抑制胰酶作用; PBS清洗一次后, 将组织块贴至培养瓶瓶壁, 1 h后加入1 mL生长液, 37 °C培养24 h后补加培养液至5 mL; 此后每3天换液一次。待15 d后可见细胞开始从组织块长出, 再培养5 d后即可传代。

1.2.2 细胞传代 待组织块周围细胞均长成致密的单层后即可进行细胞传代。弃去生长液, PBS清洗一次后加入0.25%胰蛋白酶1 mL, 37 °C消化1～2 min后加入5 mL新鲜生长液; 轻拍瓶壁分散细胞,补加生长液至15 mL后吸出一半至另外一个培养瓶(1:2传代); 37 °C, 5% CO2条件下培养, 待长成单层后, 再按上述方法传代。

1.2.3 细胞冻存 用0.25%胰酶消化、收集对数生长期细胞, 离心后弃去上清液; 加入新鲜配制的冻存液[小牛血清 90%, 二甲基亚砜 (dimethyl sulfoxide, DMSO, Amresco) 10%]制备成 2×106个/mL的细胞悬液, 每个冻存管分装1 mL; 冻存管置于程序冻存盒(Nalgen)内, -80 °C过夜后, 移入液氮内长期保存。

1.2.4 细胞复苏 从液氮中取出冻存管后迅速放入37 °C水浴中, 让细胞在1～2 min内完全融化;在无菌环境下将细胞接种到培养瓶内, 37 °C, 5%CO2条件下培养。3 d后细胞即可长成单层。

1.3 细胞生长评价

参照Mosmann (1983)的方法, 测定5、10、20和25代的细胞生长率。细胞按1×104个/mL密度接种于96孔培养板内, 每孔接种180 μL。37 °C培养24 h后, 每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT[3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐,3-(4,5)-dimethylthiazol (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, Sigma], 重复做 5个孔 。继续培养 4 h,小心吸出上清, 每孔加入150 μL的DMSO, 10 min后, 于振荡器上振摇 10 min, 并在酶标仪(BIORAD-680)上测定570 nm波长下的吸光度值(optical density value, OD)。以后每天按此方法测定5孔细胞的OD值, 连续测定7 d。以培养时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞的生长曲线。

1.4 免疫荧光染色法鉴定细胞来源

将对数生长期的细胞接种到置于6孔板内, 且已灭菌的7 mm×22 mm盖玻片上, 培养24 h后吸去培养液, 用冰冷的PBS漂洗3次; 4%的多聚甲醛室温下固定细胞 15 min, 用含 0.03% Triton-100的PBS (PBST) 漂洗3次, 每次5 min; 加入1% BSA(bovine serum albumin, 牛血清白蛋白, Amresco)室温封闭20 min, PBS漂洗3次, 每次5 min; 分别加鼠抗人波形蛋白和鼠抗人平滑肌α-actin (肌动蛋白)单克隆抗体(1:200, Dako), 4 °C孵育过夜; PBS漂洗细胞3次, 每次3 min, 加入Cy3标记的羊抗鼠IgG二抗, 37 °C孵育30 min; PBST漂洗3次, 每次5 min, 用含 DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚,4',6-diamidino-2-phenylindole, Sigma) 的封片液封片后, 荧光显微镜下观察并照相。

1.5 细胞遗传学分析

1.5.1 染色体标本制备 在细胞对数生长期, 每10 mL 培养液加入 20 μL 秋水仙素(100 μg/mL,Sigma), 处理细胞 60 min后弃去培养液; 用0.25%胰酶消化细胞 1～2 min, 然后加入适量的生长液抑制胰酶作用; 混匀细胞悬液, 离心后弃上清,用0.075 mol/L KCl溶液低渗处理细胞15 min, 离心后加入甲醇:冰乙酸(3:1)固定细胞3次; 以空气干燥法制片。

1.5.2 染色体带型分析 参照 Seabright (1971),Summer (1972) 和 Goodpasture & Bloom (1975)的方法进行G带、C带和Ag带显示。

1.5.3 荧光原位杂交 参照Nie et al (2009) 的方法,利用石鸻 (Burhinus oedicnemus, 鸻形目) 的 Z和W 染色体特异探针与朱鹮的中期染色体进行荧光原位杂交, 鉴别朱鹮的性染色体。

1.6 图像拍摄与分析

用装有 CCD摄像装置的蔡司荧光显微镜(Axioplan 2, Zeiss company)和图像分析软件(CytoVision system, Applied Imaging Corp, UK)进行图像拍摄和分析。

2 结果与讨论

2.1 朱鹮皮肤细胞系的建立

在陕西朱鹮人工繁殖中心获得两只朱鹮(雌、雄各一只)的皮肤样品后, 置于运输液中运送到昆明。原代培养 15 d后, 有细胞从组织块周围长出(图 1 A), 继续培养5 d后细胞长成致密单层(图1 B), 即可以 1:2的比例进行传代培养, 以维持细胞增殖。我们对 10代以前不同代数的细胞进行冷冻保存,成功建立了两株朱鹮细胞系, 分别命名为 KCB 201253S（雄性)和KCB 2012055S（雌性)。细胞均为典型的成纤维样细胞, 且支原体污染检测（荧光法)结果均为阴性。冻存的朱鹮细胞在复苏后能够正常生长, 且生长速度与冻存前相比并未减低。

图1 培养的朱鹮细胞形态Fig. 1 Morphology of N. nippon cultured cells

为优化培养条件, 我们选用了不同的培养基如DMEM、MEM和OPTI-MEM (GIBCO)同时培养朱鹮细胞, 并添加相同比例牛血清, 经比较发现OPTI-MEM培养基最适宜朱鹮细胞的生长。

为鉴别所建立的朱鹮细胞系的来源, 我们采用免疫荧光染色的方法, 用两种不同的抗体对培养的朱鹮细胞进行免疫抗体染色。 结果显示在朱鹮细胞中鼠抗人波形蛋白抗体染色为阴性, 而鼠抗人平滑肌α-actin抗体染色为强阳性(图2, 呈束状的红色荧光显示肌丝特征)。鼠抗人平滑肌 α-actin抗体只与血管平滑肌细胞中的actin的α异构体特异性结合, 而与成纤维细胞中的β-、γ-actin均不能结合。因此该抗体可以作为血管平滑肌细胞的鉴定(Cai et al, 2005)。免疫荧光染色的结果提示我们建立的朱鹮细胞系来源于血管平滑肌组织。体外培养细胞源于动物机体, 而机体内的细胞都混杂生长, 每一种组织都有血管和间叶组织, 因此, 由动物体来源的培养材料而进行的原代培养, 绝大多数都呈各种细胞混合生长（Zhou, 2006)。我们所取的朱鹮皮肤样品中也含有血管, 在剪小的组织块中包含有血管平滑肌组织, 在原代培养时包括血管平滑肌细胞在内的各类细胞均可从组织块中长出, 因此, 可能在后续的传代培养过程中, 血管平滑肌细胞成为优势细胞而保留下来。

图2 朱鹮细胞的平滑肌肌动蛋白抗体免疫荧光染色Fig. 2 Immunofluorescence staining of smooth muscle special actin in N. nippon fibroblast cells

2.2 朱鹮细胞生长特性分析

利用MTT法, 我们测定了连续培养7 d的不同传代数的朱鹮细胞生长情况。 图3为5、10、20和 25代朱鹮细胞的生长曲线。体外培养的朱鹮细胞表现出了典型的“潜伏期—对数生长期—停滞期”的生长模式。在细胞传代过程中, 我们发现不同代数细胞的增殖能力和形成单层的时间有所不同。传代数＜10的细胞, 轮廓清晰、立体感强且增殖能力强, 3 d即可形成致密单层; 传代数＞15的细胞, 形成单层的时间逐渐延长, 到20代以后, 细胞增殖能力明显减慢, 5 d才可形成单层; 传代数＞25的细胞,形态扁大, 显现衰老特征且不能再形成单层。因此,我们所建立的朱鹮细胞系为有限细胞系, 为保证细胞的旺盛生长力, 需在建系早期多冻存传代数低的细胞, 且要避免长时间连续传代细胞。

图3 不同传代数的朱鹮细胞生长曲线Fig. 3 Growth curves of N. nippon cells of different passages

2.3 细胞遗传学分析

为证实我们所建立的细胞系确实来源于朱鹮,排除培养过程中可能发生的细胞交叉污染, 我们制备了这两株培养朱鹮细胞的中期染色体, 并进行了以下细胞遗传学分析。

染色体数目和形态 鸟类染色体所具有的大量微小染色体在使用Giemsa染液染色时着色较浅(图4A), 在染色体分散不理想时不易计数。为了准确计数微小染色体, 我们采用能使所有鸟类染色体均匀着色的荧光染料碘化丙啶 (propidium iodine, PI,Amresco) 对所制备的中期染色体进行染色(图4B)。对100个中期分裂相的计数结果表明, 细胞的染色体众数为2n=68, 包括性染色体在内有10对大染色体, 其余为微小染色体。我们的结果与Liu et al（1992)报道的朱鹮核型分析结果一致, 证明我们所建立的细胞系确实来源于朱鹮。

带型分析 目前, 有关朱鹮显带染色体未见报道。在本研究中, 我们首次进行了朱鹮染色体 Ag带、C带(图4C, D)和G带(图5)显示。在所观察的20个细胞中, 银染的核仁组织者区(nucleolar organizer region, NOR)分布在一对微小染色体上(图4C, 箭头所示)。C带(异染色质)主要分布在多数大染色体的着丝粒区域, 微小染色体多为 C带阳性,表明其微小染色体含有丰富的异染色质。W染色体和Z染色体的长臂末端均为C带阳性(图4D, 箭头所示)。朱鹮的染色体 C带与已报道的家鸡的染色体C带相似(Pollock & Fechheimer, 1981)。图5为朱鹮的 G带核型图, 染色体排列方式参照 Liu et al(1992)的报道, 按染色体的相对长度, 从长到短进行排列。G带分析结果表明, 除雌性性染色体为异配的ZW以及雄性性染色体为同配的ZZ外, 雌、雄个体的G带核型一致; Z染色体为中着丝粒染色体, 相对长度仅次于第5号染色体; W染色体长度约为Z染色体的一半。这些结果与Liu et al(1992)的报道一致。虽然可以根据性染色体为同配或异配来鉴别鸟类的性别, 但鸟类的W染色体较小, 长度与一些较小的常染色体相当, 因此, 在常规染色的分裂相中, 仅根据外形, 很难准确鉴别 W 染色体(Shields,1982)。对于朱鹮W染色体的形态, Takasi &Sasaki（1974)的报道为亚端着丝粒染色体, Liu et al（1992)认为是中着丝粒染色体, 而我们的G带核型分析支持其为亚端着丝粒染色体（图5)。

图 4 不同染色和显带的朱鹮染色体Fig. 4 Examples of N. nippon chromosomes with different staining and banding

图5 朱鹮的G带核型Fig. 5 G-banded karyotype of N. nippon

朱鹮性染色体鉴别 在以前的研究中, 通过流式分选, 我们已获得了石鸻 (B. oedicnemus, 鸻形目)的Z和W染色体特异探针(Nie et al, 2009)。为准确鉴别朱鹮的性染色体, 特别是W染色体, 我们利用石鸻的Z和W染色体特异探针, 分别与雄、雌性朱鹮的中期分裂相进行荧光原位杂交(图6A, B)。在雄性朱鹮的中期分裂相中, 石鸻的Z染色体探针涂染了一对中着丝粒染色体(图 6A), 即 Z染色体,与核型分析确定的Z染色体一致。在雌性朱鹮的中期分裂相中, 石鸻的 W 染色体探针涂染了一条较小的亚端着丝粒染色体(图6B), 直接证明W染色体是一条较小的亚端着丝粒染色体(图 6C)。另外, 石鸻的Z和W染色体探针分别在朱鹮的一对微小染色体和Z染色体长臂的末端有交叉杂交的信号。这种交叉杂交的信号, 在以石鸻的Z和W染色体探针与家鸡的中期分裂相进行荧光原位杂交的实验中也曾被检测到(Nie et al, 2009), 表明石鸻的Z和W染色体探针中包含有与被杂交的染色体同源的序列, 这些同源的序列可能是重复序列。

图6 荧光原位杂交示例Fig. 6 Examples of fluorescent in situ hybridization

近期, 西安交通大学和华大基因已合作完成了朱鹮全基因组序列图谱绘制。朱鹮体细胞系的成功建立, 不仅保存了这一珍稀濒危鸟类的遗传资源,也为后续开展其基因定位和其它生物学研究提供了实验材料。在本研究中所建立的朱鹮体细胞培养的方法, 也可以用于其他鸟类的体细胞系建立和保藏。

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