MTT法检测没食子酸对两种细胞的体外毒性

严晓莺，陈巨鹏，王明艳

(1．南京中医药大学，江苏 南京 210046，2．江苏省中医院，江苏 南京 210029)

没食子酸(gallic acid，GA)又名五倍子酸，化学名3，4，5－三羟基苯甲酸，是一种多酚类化合物，广泛存在于中草药山茱萸、五倍子、芍药［1］及植物葡萄、石榴的果皮中。GA可以抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡［2－3］，但是对正常细胞的毒性研究报道并不多见。本实验选用MTT实验检测GA对体外生长的人正常肝细胞株LO2和人肝癌细胞株SMMC－7721增殖的影响，为其开发为新药提供理论依据。

1 材料

1．1 药品

没食子酸(GA，分子量170，中国药品生物制品检定所，批号110831－200803);顺铂(DDP，齐鲁制药有限公司，批号0070332DC)。

1．2 细胞株

人正常肝细胞株 LO2、人肝癌细胞株 SMMC－7721均由本实验室提供。

1．3 试剂

RPMI－1640培养液、胎牛血清(FBS)、小牛血清(NBS)(GIBCO公司);乙二胺四乙酸(EDTA)(SOLARBIO公司);磷酸缓冲盐(PBS)(博士德公司);溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(AMRESCO公司)。

1．4 仪器

图像获取系统(OlympusDP71);倒置显微镜(MoticAE31);全自动酶标仪(Bio－Rad680723);超低温冰箱(MDF－382ECM);CO2恒温培养箱(日本SANYO);超净工作台(苏州净化设备有限公司);电热恒温水浴箱(上海精宏实验设备有限公司);电子分析天平(AY220，日本岛津)。

2 实验方法

2．1 药液的配制

精确精密称取没食子酸17mg，生理盐水定容至10ml充分溶解，配成浓度为10mmol/L的储存液，0.22um滤器过滤除菌，－20℃避光保存，临用前用培养液稀释至实验所需的终浓度。

2．2 细胞培养

复苏冻存的细胞，离心去除冻存液，加入含10%血清的RPMI－1640培养液(pH值7．2)，于37℃饱和湿度、5%CO2孵箱中静置培养。细胞生长到80%后，加入 1ml消化液(含 0．02%EDTA，0．25%胰酶)消化，待细胞变圆，间隙增大时，弃消化液，加入2ml培养液终止消化，轻轻吹打制成单细胞悬液，LO2按1/4比例传代，SMMC－7721按1/8比例传代，每3～4天传1次。

2．3 MTT 检测［4］

分别取对数生长期的LO2细胞和SMMC－7721细胞制成密度为5×104个/ml的细胞悬液，每孔100μl接种于96孔板中培养。分为阴性对照组、不同剂量加药组和阳性对照组，每组设5个平行孔，细胞贴壁以后，弃去旧的培养液，更换新的培养液，加药组培养液含有 GA，终浓度分别为 6．25、12．5、25、50、100μmol/L，阳性对照组培养液含有顺铂，终浓度为5μg/ml。药物作用细胞后 24h、48h、72h，取出培养板，每孔加入 5mg/ml的 MTT 10μl，混匀，继续培养 4h，弃去上清液，每孔加入100μl DMSO，震荡10min使结晶充分溶解，酶标仪测每孔吸光度，波长490nm。抑制率(%)=1－用药组OD值/阴性对照组OD值×100%。

2．4 统计学处理

使用SPSS 13．0进行单因素方差分析(One way ANOVA)，实验数据以均数±标准差(±s)表示，P＜0．05为差异具有统计学意义。

3 结果

不同剂量的GA作用24h、48h、72h对体外培养的LO2和SMMC－7721细胞均有一定的抑制作用。

3．1 GA对LO2细胞的生长的影响

6．25 、12．5、25、50、100μmol/L 剂量组与阴性对照组相比有显著性差异(P＜0．05)，对LO2细胞有增殖抑制作用，且呈剂量依赖关系，25、50、100μmol/L浓度组对LO2细胞的抑制随作用时间的延长而升高，呈现时间依赖关系(见表1)。

表1 没食子酸作用24、48、72h对LO2细胞增殖的影响(±s)

表1 没食子酸作用24、48、72h对LO2细胞增殖的影响(±s)

注:与阴性对照组比较，*P ＜0．05。

药物浓度(μmol/L)与分组24h抑制率(%)48h抑制率(%)72h抑制率(%)阴性对照组0006．25 18．1 ±10．9* 17．4 ±18．5* 17．4 ±9．5*12．5 25．5 ±10．1* 38．6 ±3．7* 36．3 ±9．7*25 42．0 ±10．2* 44．9 ±9．6* 47．8 ±2．9*50 42．5 ±9．7* 47．9 ±8．7* 63．7 ±11．3*100 51．8 ±6．0* 64．9 ±5．1* 77．6 ±5．9*顺铂组(5μg/ml)32．4 ±10．4* 56．8 ±9．1* 79．0 ±4．9*

3．2 GA对SMMC－7721细胞的生长的影响

6．25 、12．5、25、50、100μmol/L 剂量组与阴性对照组相比有显著性差异(P＜0．05)，对SMMC－7721细胞有增殖抑制作用，且呈剂量依赖关系，各浓度组对细胞的抑制率随时间延长而增高，呈现时间依赖关系(见表2)。

表2 没食子酸作用24、48、72h对MMC－7721细胞增殖的影响(±s)

表2 没食子酸作用24、48、72h对MMC－7721细胞增殖的影响(±s)

注:与阴性对照组比较，*P ＜0．05。

药物浓度(μmol/L)与分组24h抑制率(%)48h抑制率(%)72h抑制率(%)阴性对照组0006．25 16．3 ±9．0* 20．0 ±5．6* 42．2 ±7．0*12．5 22．4 ±10．7* 31．0 ±4．6* 65．7 ±3．1*25 23．1 ±13．7* 49．4 ±2．9* 72．4 ±4．8*50 41．9 ±10．8* 56．1 ±4．5* 82．7 ±1．92*100 44．1 ±8．6* 58．3 ±2．8* 81．8 ±4．2*顺铂组(5μg/ml)18．6 ±8．1* 38．0 ±5．1* 53．5 ±3．2*

3．3 GA对LO2和SMMC－7721细胞影响的比较

由图1－3可以看出，没食子酸对LO2和SMMC－7721 都有增殖抑制作用;作用 24h 时，6．25、12．5、25、100μmol/L剂量组对LO2细胞的抑制高于SMMC－7721，50μmol/L剂量组对两种细胞的抑制相仿;作用48h后，25、50μmol/L剂量组对 SMMC－7721细胞抑制率开始高于对LO2细胞的抑制;作用72h后，6．25、12．5、25、50μmol/L 剂量组对 SMMC－7721 细胞的抑制率明显高于对LO2细胞的抑制，对二者抑制率的差距增大，但100μmol/L剂量组对LO2细胞的抑制还是与对SMMC－7721的抑制接近。

图1 没食子酸作用24h对两种细胞增殖抑制

图2 没食子酸作用48h对两种细胞增殖抑制

图3 没食子酸作用72h对两种细胞增殖抑制

综上可知，GA对LO2细胞和AMMC－7721细胞均有抑制作用;50μmol/L剂量组的GA对LO2的抑制较小，而对SMMC－7721的抑制较大。

4 讨论

原发性肝癌(简称肝癌)为常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，严重威胁着人类健康和生命。该病发病早期无特异性表现，大部分患者就诊时已处于中晚期阶段，现行的常规的治疗手段效果不甚理想。中医药治疗肝癌在稳定病灶、延长生存时间、改善生存质量等方面发挥了显著的疗效，不仅单用有效，而且可与手术、放疗、化疗联合运用提高临床疗效和减少毒副反应。

GA作为天然植物中提取的多酚类化合物具有抗氧化、抗自由基作用。然而在金属离子存在的情况下GA表现为强氧化剂的作用［5］，促进细胞 DNA的损伤，诱导其凋亡，而这种损伤是可以被过氧化氢酶阻止［6］。有研究表明，细胞内过氧化氢酶在细胞中的含量高低决定了对GA的敏感性不同［7］，近年来GA的抗肿瘤作用越来越受到人们的重视。

鉴于绝大多数的化疗药物对正常细胞杀伤作用也很大，我们采用MTT实验检测GA对正常肝细胞和肝癌细胞的增殖抑制作用，期望能为寻找有效的减毒增效拮抗剂提供线索。结果表明，抗肿瘤单体GA对LO2和SMMC－7721细胞均有一定的毒性，表现为增殖抑制作用，作用早期(24h)对LO2的抑制大于对SMMC－7721的抑制，连续作用后(48h、72h)，对SMMC－7721细胞的损伤明显超过对LO2的抑制。综上所述，在充分发挥GA抗肿瘤作用的情况下，如何降低其对正常细胞的影响，需要进一步研究。

［1］ 李玉东，刁勇，王立强．芍药及其有效成分抗肿瘤作用的研究进展［J］．海峡药学，2009，21(12):27－32．

［2］ Lo C，Lai TY，Yang JS，et al．Gallic acid inhibits the migration and invasion of A375．S2 human melanoma cells through the inhibition of matrix metalloproteinase－2 and Ras［J］．Melanoma Res，2011，21(4):267－273．

［3］ You BR，Kim SZ，Kim SH，Gallic acid－induced lung cancer cell death is accompanied by ROS increase and glutathione depletion［J］．Mol Cell Biochem，2011，357(1－2):295－303．

［4］ 梁颖，张晓莉，陶冀，等．红花多糖对人肝癌SMMC－7721细胞增殖的抑制作用［J］．中医药学报，2011，39(5):32－35．

［5］ Inoue M，Suzuki R，Sakaguchi N，et al．Selective induction of cell death in cancer cells by gallic acid［J］．Biol Pharm Bull，1995，18(11):1526－1530．

［6］ Yoshino M，Haneda M，Naruse M，et al．Prooxidant action of gallic acid compounds:copper－dependent strand breaks and the formation of 8－hydroxy－2＇－deoxyguanosine in DNA［J］．Toxicol In Vitro，2002，16(6):705－709．

［7］ Isuzugawa k，Inoue M，Ogihara Y．Catalase contents in cells determine sensitivity to the apoptosis inducer gallic acid［J］．Biol Pharm Bull，2001，24(9):1022－1026．