不同冷冻载体对小鼠成熟卵母细胞玻璃化冷冻的影响

海 兰，谭 丽 ，毛跟红，马丽影，赵冬梅，项云改，李 艳

1)美国南伊利诺伊大学医学院生理系 卡本戴尔62901 2)郑州大学第二附属医院生殖中心 郑州450014

#通讯作者，女，1964年3月生，博士，教授，研究方向:生殖内分泌，E－mail:litan668@zzu.edu.cn

成熟的减数第二次分裂中期(MⅡ期)卵母细胞的冷冻保存是目前最佳的生殖能力储备方法。玻璃化冷冻技术因操作简便、快捷高效、节约成本而受到青睐。由于玻璃化冷冻保护剂的高浓度、高毒性易造成冷冻过程中卵母细胞的损伤，冷冻载体及方法的选择一直是相关研究中的热点，但面对多种载体，人们尚未找到最佳的方案。该实验采用普通麦管、封闭式拉细麦管(closed pulled straws，CPS)和开放式拉细麦管(open pulled straws，OPS)玻璃化冷冻小鼠MⅡ期卵母细胞，观察复苏后体外受精及发育潜能，旨在找寻一种相对高效而且经济实用的冻存方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与动物

玻璃化冷冻液的制备:参考文献［1］的方法。以美国Gibco 公司生产的Dulbecco’s 磷酸缓冲液(DPBS)加入体积分数10%的胎牛血清(FBS)为基础冷冻保护液，基础冷冻保护液中加入1.5 mol/L的乙二醇(美国Sigma 公司)为预平衡液，基础冷冻保护液加入5.5 mol/L 的乙二醇和1.0 mol/L 的蔗糖为玻璃化冷冻液。复苏液采用四步复苏法配制，在基础冷冻保护液的基础上分别加入1.000、0.500、0.250、0.125 mol/L 的蔗糖。将所配制的玻璃化冷冻液及复苏液离心、过滤后置于4℃冰箱避光保存，于取卵日取出于室温下静置。授精液滴的配制:将含体积分数5%FBS 的1020 液在35 mm 的培养皿中制成50 μL 的微滴，表面以矿物油覆盖。生长液滴的配制:将含体积分数5%FBS 的1026 液在培养皿中制成20 μL 的微滴，表面以矿物油覆盖。授精液滴和生长液滴均在取卵当天配制完毕并置于37℃、体积分数5%CO2的培养箱中平衡6 h 以上。

6～8 周龄的健康普通级昆明系雌性小鼠15只，体质量20～25 g，用于获取成熟的卵母细胞。8～15 周龄的健康普通级昆明系雄性小鼠，体质量30～35 g，用于获取精子。以上小鼠均购自河南省实验动物中心。清洁普通级动物饲养标准饲养。

1.2 成熟卵母细胞的采集 15 只6～8 周龄雌性小鼠于晚22:00 时分别腹腔注射10 IU 人绝经期促性腺激素(HMG)，48 h 后再次腹腔注射10 IU 人绒毛膜促性腺激素(HCG)，16～18 h 后以颈椎脱臼法处死，无菌操作下打开腹腔，分离并剪下输卵管和卵巢，在DPBS 中清洗3～4 遍后迅速移至含体积分数5%FBS 的1020 液的带凹皿中。解剖显微镜下用1 mL 注射器撕开输卵管的膨大部，收集卵母细胞和卵母细胞复合体COCs。根据COCs 的形态学判断卵母细胞的成熟度［2］。共取得可见第一极体的成熟MⅡ卵母细胞166 枚，将其移入含有体积分数5%FBS 的1020 授精液滴中，并放入培养箱中等待冷冻。

1.3 实验分组与玻璃化冷冻与复苏处理 将成熟的卵母细胞按照随机数字表法分为冻融组、暴露组和对照组。冻融组卵母细胞分别用普通麦管、CPS、OPS 载体进行玻璃化冷冻。暴露组将新鲜的成熟卵母细胞分别暴露于玻璃化冷冻液和复苏液中，但未投入液氮中进行冷冻。对照组卵母细胞直接进行体外受精，不接触冷冻液和复苏液。将小鼠MⅡ期卵母细胞于预平衡液中平衡5 min，然后移入玻璃化冷冻液中。普通麦管和CPS组采用气柱五段式装管法［3］。OPS组装管时手持麦管的一端，用另一端轻触冷冻液滴，卵母细胞和微量的玻璃化冷冻液(大约1～2 μL)便会因虹吸作用进入细管的前端。装管后的麦管立即直接投入液氮中。各种装管过程均需严格控制在1.0～1.5 min。卵母细胞的复苏:普通麦管和CPS组均从液氮中取出麦管，室温下停留5 s，37℃水浴10 s［2］，用无菌剪刀在远端(第一段空气柱处)剪断，将含有卵母细胞的一段液体排至含1.000 mol/L 蔗糖的复苏液中，静置2.5 min 后再依次 移 至 分 别 含 有0.500 mol/L、0.250 mol/L、0.125 mol/L蔗糖复苏液中，每孔停留2.5 min。最后将复苏存活的卵母细胞放入基础液中清洗，然后移入授精液滴等待受精。OPS组从液氮中取出后首先气浴5 s，随后将远端直接浸入含1.000 mol/L 蔗糖的复苏液中，待玻璃化部分液化以后便与复苏液融合，静置2.5 min 后剩余步骤与上述相同。冷冻和复苏均须在24～26℃室温下进行，同时避光。

1.4 卵母细胞体外受精及卵裂 对于复苏后及暴露后体外培养1 h 后形态正常的卵母细胞［细胞存活，无胞质的碎裂和(或)透明带的松解或脱落］进行体外受精。在授精液滴中每个MⅡ期卵母细胞周围加5～10 万条精子，然后移至37℃、体积分数5%CO2培养箱中。授精后16～24 h 在倒置显微镜下(×200)观察受精及卵裂情况。胚胎质量的评估参照卢惠霖等［4］的标准。

1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0 处理数据，各组小鼠成熟卵母细胞的回收和存活率的比较应用χ2检验或精确概率法。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同载体玻璃化冷冻复苏的小鼠成熟MⅡ期卵母细胞的回收和存活率比较 见表1。

表3 各组小鼠卵母细胞回收及存活率比较

2.2 不同方法处理卵母细胞玻璃化冷冻复苏后体外受精及胚胎发育情况 见表2。

表2 不同方法处理卵母细胞玻璃化冷冻复苏后体外受精及胚胎发育情况

3 讨论

生殖技术的应用过程中，取卵日精液或精子无法取出的情况时有发生，如果能将卵子冷冻保存将是最佳的补救措施，否则在没有供精可选或不愿用供精时只能废弃所获得的卵子，这不仅是一种经济浪费，而且是对女性生育力的极大浪费。寻找一种简便、快捷、经济有效的卵子冷冻法逐渐成为相关研究中的焦点。随着玻璃化冷冻技术的发展，卵母细胞冷冻获得快速发展［5－6］。与慢速冷冻相比，卵母细胞玻璃化冷冻具有简单快捷而且高效的优点，且玻璃化冷冻的临床妊娠率高于慢速冷冻法［7］。

目前，文献报道较多的玻璃化冷冻载体为Cryoloop、Cryoleaf 等，价格昂贵。作者选择了价钱相对低廉且制作方法简单的普通麦管及CPS 和OPS 用于实验。结果显示，CPS 和OPS组复苏后卵母细胞的存活率差异无统计学意义，但均高于普通麦管组。这一结果与Chen 等［8］的研究结果相符。影响存活率的首要原因是冷冻速率的不同。普通的0.25 mL冷冻麦管内径大约1.7 mm，管壁厚度约为0.15 mm，其装载的冷冻保护剂体积几乎为拉细麦管(内径0.8 mm，管壁厚度0.07 mm)的2 倍。液体容量的增加意味着热传递耗时的延长。且普通麦管组采用多段式方法装管，装管时间的延长也在一定程度上增加了卵母细胞与乙二醇的接触时间。因此拉细麦管作为卵母细胞冷冻的载体优于普通麦管。由于CPS 在回收率方面优于OPS，而且封闭式避免了胚胎与液氮接触所造成的潜在污染，因此是较理想的载体。

由于高浓度冷冻保护剂对胚胎有一定的毒性，该实验中，降低玻璃化冷冻保护剂乙二醇的浓度为5.5 mol/L，蔗糖浓度为1 mol/L。为了检测卵母细胞对冷冻保护液的耐受性，作者另外设置了暴露组，即将小鼠成熟卵母细胞按照冷冻复苏的顺序先后在各个浓度梯度的冷冻复苏液中依次停留规定的时间但未装管且无投入液氮避免了冷冻复苏液对卵母细胞的影响，结果表明，仅有1 枚卵母细胞在此过程之中发生胞质颜色变暗及细胞的死亡，其原因可能源于操作技能，其余卵均存活，说明在没有冷冻的条件下，卵母细胞是有能力抵御并承受住由高浓度的冷冻保护剂到浓度逐渐降低的复苏液所带来的渗透压的改变，而且受精率达89.7%，这一结果与Chen等［8］观察到的结果相符合。该研究中新鲜及冻融的小鼠卵母细胞均采用体外受精，冻融组的卵裂率为38.6%，较对照组和暴露组降低。由于冻融后卵子透明带变厚会影响卵裂率和植入率，如果采用卵胞浆内单精子注射(ICSI)和透明带去除或打孔的方法则可以大大提高卵母细胞冻融后的卵裂率，将会获得更高的卵裂率。

综上所述，普通麦管法是效率最低的玻璃化冷冻方法，OPS 的冷冻效率最高，然而却存在着潜在的感染风险［9］。在临床应用中，无菌的控制和污染的避免是先决条件，因此CPS 在玻璃化冷冻保存成熟的卵母细胞方面的价值值得肯定。

［1］Zhou XL，Al Naib A，Sun DW，et al.Bovine oocyte vitrification using the cryotop method:effect of cumulus cells and vitrification protocol on survival and subsequent development［J］.Cryobiology，2010，61(1):66

［2］罗丽兰.不孕与不育［M］.2 版.北京:人民卫生出版社，2009.

［3］Stachowiak EM，Papis K，Kruszewski M，et al.Comparison of the level(s)of DNA damage using comet assay in bovine oocytes subjected to selected vitrification methods［J］.Reprod Domest Anim，2009，44(4):653

［4］卢惠霖，卢光琇.人类生殖与生殖工程［M］.郑州:河南科学技术出版社，2001.

［5］严正杰，蔡令波，冯婷，等.卵母细胞玻璃化冷冻对胚胎发育及妊娠结局的影响［J］.生殖医学杂志，2009，18(1):17

［6］Liu L，Milroy C，Peterson CM，et al.Successful cryoloop vitrification and subsequent in vitro maturation of mouse preantral follicles［J］.Syst Biol Reprod Med，2011，57(3):149

［7］Smith GD，Serafini PC，Fioravanti J，et al.Prospective randomized comparison of human oocyte cryopreservation with slow－rate freezing or vitrification［J］.Fertil Steril，2010，94(6):2088

［8］Chen SU，Lien YR，Chen HF，et al.Vitrification of mouse oocytes using CPS achieves a high survival and preserves good patterns of meiotic spindles，compared with conventional straws，OPS and grids［J］.Hum Reprod，2001，16(11):2350

［9］Parmegiani L，Cognigni GE，Bernardi S，et al.Efficiency of aseptic open vitrification and hermetical cryostorage of human oocytes［J］.Reprod Biomed Online，2011，23(4):505