靛玉红甲肟对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡的影响*

刘晓莉，刘怀民 ，高启龙，陈小兵，张成娟，杨 峰

1)河南省肿瘤医院中西医结合科郑州450008 2)河南省肿瘤医院肿瘤内科郑州450008 3)河南省肿瘤医院病理科郑州450008#通讯作者，男，1970年3月生，博士，副主任医师，研究方向:消化道肿瘤的中西医结合治疗，E-mail:lhm1970311@126.com

食管癌是消化系统常见恶性肿瘤，以手术为主的综合治疗是其主要治疗手段; 但食管癌化疗的效果并不理想，复发转移率较高。靛玉红是传统中成药当归龙荟丸中青黛的抗肿瘤有效成分，其衍生物靛玉红甲肟(分子式为C16H11N3O2，相对分子质量为277.3)是具有新型结构的抗肿瘤药。靛玉红及其衍生物可抑制人体多种肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞周期阻滞，促进肿瘤细胞凋亡［1］。作者的前期研究［2］发现靛玉红甲肟可抑制食管癌EC-1 和Kyse70 细胞增殖，但具体分子机制尚不完全明确。该研究观察了靛玉红甲肟对人食管癌EC9706 细胞体外增殖和凋亡的影响，初步探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 靛玉红甲肟购自美国Sigma 公司，取5 mg 溶于1 mL 二甲基亚砜(DMSO)中，配成18 mmol/L 的母液，过滤除菌备用。甲基噻唑蓝(MTT)及DMSO、胎牛血清、RPMI 1640 培养液。EC9706 细胞系购自上海细胞库。

1.2 细胞培养 EC9706 细胞用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液(含青霉素、链霉素各100 U/mL)，在37℃、体积分数5% CO2及饱和湿度条件下培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 细胞增殖抑制率检测 用2.5 g/L 胰蛋白酶消化对数生长期细胞，加入含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液，调整细胞浓度为2×104mL－1，接种于96 孔培养板中。培养24 h，贴壁后弃去上清，分别加入浓度为0、1、5 及10 μmol/L 的靛玉红甲肟，每组5 个复孔; 继续培养12、24 及48 h后，MTT 法测增殖抑制率，检测波长为570 nm。测定各孔吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率=(对照组A 值－实验组A 值)/对照组A 值×100%。

1.4 细胞凋亡检测 EC9706 细胞用10 μmol/L 靛玉红甲肟作用0、24、48、72 h 后，用2.5 g/L 胰蛋白酶消化收集，吹打制备单细胞悬液，保证每管细胞数至少达1×106个。将100 μL 细胞悬液加入5 mL培养管中，加入Annexin V-FITC 和活细胞染料PI，轻轻混匀，室温避光孵育15 min，加入400 μL PBS，1 h 内上流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。

1.5 Sox-2 mRNA 检测 分别用浓度为0、1、5 及10 μmol/L 的靛玉红甲肟作用于EC9706 细胞48 h后，收集各组细胞，利用RNeasy Mini 试剂盒提取细胞RNA 并纯化，用一步法RT-PCR 试剂盒对提取的RNA 进行逆转录，上PCR 机扩增，琼脂糖凝胶电泳后，采用Gel Doc 2000TM凝胶图像分析仪采集图片，用Quantity One 软件对条带灰度值进行分析。Sox-2上游引物序列5’-TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA-3’，下游引物序列5’-CTGGGGCTCAAACTTCTCTC-3’，产物长度为76 bp。内参β-actin 上游引物序列5’-CAACGCGAACCGCGAGAAGATG-3’，下游引物序列5’-GTCGAGGGCGACGTAGCAGAGG-3’，产物长度为330 bp。操作按试剂盒说明书进行。以目的条带与β-actin 条带灰度值的比值表示目的基因mRNA 的相对表达量。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0 数据处理，采用4×3 析因设计的方差分析对细胞增殖抑制率进行分析，采用单因素方差分析对各组细胞凋亡率和Sox-2 mRNA 的相对表达量进行比较，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 靛玉红甲肟对EC9706 细胞增殖的影响 增殖抑制率测定结果见表1。由表1可以看出，随着靛玉红甲肟浓度的增大和作用时间的延长，EC9706 细胞的增殖抑制率也逐渐增加，呈剂量和时间依赖性。

表1 各组EC9706 细胞增殖抑制率测定结果(n=5)%

2.2 靛玉红甲肟对EC9706 细胞凋亡的影响 经10 μmol/L 靛玉红甲肟作用后，随作用时间延长，细胞凋亡率逐渐增加，0、24、48 和72 h 的凋亡率分别为(2.7±1.5)%、(10.4±1.3)%、(19.1±1.4)%和(29.3± 2.6)%，差异有统计学意义(F =195.350，P ＜0.001)。

2.3 靛玉红甲肟对EC9706 细胞Sox-2 mRNA 表达的影响 RT-PCR 结果见图1。0、1、5 和10 μmol/L 靛玉红甲肟作用48 h 后，EC9706 细胞Sox-2 mRNA 的相对表达量分别为(0.974± 0.059)、(0.720±0.042)、(0.657± 0.074)和(0.401±0.039)，逐渐下降(F=87.552，P ＜0.001)。

图1 靛玉红甲肟作用后EC9706 细胞Sox-2 mRNA 的表达

3 讨论

靛玉红作为抗肿瘤的有效成分已应用多年，有研究［2-3］表明，靛玉红可抑制多种肿瘤细胞的体外增殖，还可增加其他抗癌药物对耐药细胞的细胞毒性作用，临床疗效可靠，对骨髓无明显抑制作用。目前其衍生物靛玉红甲肟的抗肿瘤作用越来越受到重视。

食管癌是消化系统常见恶性肿瘤，其复发转移及化疗耐药是总体生存率不高的主要原因。在对食管癌EC-1 细胞体外生长干预实验中，研究者［2］发现靛玉红甲肟与奈达铂联用可以增强对EC-1 细胞的杀伤作用。该实验结果显示，随着靛玉红甲肟浓度的增加和作用时间的延长，EC9706 细胞的增殖抑制率也逐渐增大; 靛玉红甲肟作用后EC9706 细胞的凋亡率也逐渐增大，并呈时间依赖性;提示靛玉红甲肟体外能抑制EC9706 细胞的增殖，并可有效诱导其凋亡。

Sox 家族参与胚胎发育的转录调控，决定细胞的归宿，对多种组织器官的发育具有重要作用，并参与人类性别的决定［4］。在胚胎干细胞(ES 细胞)中，Sox-2 呈高度表达状态，它标志着ES 细胞和肿瘤干细胞(TS 细胞)具有保持未分化的全能性［5］，Sox-2 转录水平在一定程度上决定着ES 和TS 细胞的分化方向和自我更新能力［6］。在某些疾病中，Sox基因被发现可能直接参与或协助癌症的发生［7-8］。Li 等［9］认为Sox-2 蛋白的过量表达与胃癌的发生有关。作者的前期研究［10］发现，靛玉红甲肟能抑制膀胱癌细胞的增殖并可降低其Sox-2 的表达，且具有时间和剂量依赖性。该研究结果显示，靛玉红甲肟浓度从1 μmol/L 升至10 μmol/L 时，EC9706 细胞Sox-2 mRNA 的相对表达量逐渐降低，表明靛玉红甲肟可抑制EC9706 细胞中Sox-2 mRNA 的表达，该作用具有量效关系。由此推断，抑制Sox-2 的转录可能是靛玉红甲肟抑制EC9706 细胞增殖和诱导凋亡的作用机制之一。

综上所述，靛玉红甲肟对食管癌EC9706 细胞具有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用，其作用机制可能与下调Sox-2 mRNA 的表达有关，但其具体作用途径和分子机制尚需进一步研究。目前，常规化疗对TS 细胞作用微弱。靛玉红甲肟能抑制TS 细胞中Sox-2 等转录因子表达这一特性，可能为特异性杀灭TS 细胞提供了一条新的思路。

［1］吴琦玮，葛忠良，高月，等.靛玉红对肿瘤细胞抑制作用的研究及相关机制探讨［J］.天津中医药，2008，25(1):55

［2］陈小兵，张军辉，罗素霞，等.靛玉红甲肟对奈达铂抗人食管癌EC-1 细胞的化疗增效作用［J］.肿瘤防治研究，2009，36(11):914

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