肺癌组织中Nrf2、Keap1和NQO1蛋白的表达*

倪 静，秦丽娟，吴拥军 ，王 静，吴逸明

1)郑州大学公共卫生学院卫生毒理学教研室 郑州450001 2)郑州大学第一附属医院呼吸内科 郑州450052#通讯作者，男，1968年1月生，博士，教授，研究方向:生化与分子毒理，E-mail:wuyongjun@zzu.edu.cn

肺癌是我国发病率非常高的一种恶性肿瘤，其发生发展是一个多基因、多阶段的过程，是环境和遗传因素共同作用的结果［1］。从功能角度看，肺癌属蛋白组性疾病。Nrf2 是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子，Keap1 是Nrf2 的关键调节因子［2］。抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)存在于大鼠/小鼠GST A2 亚基、大鼠/人NQO1、r-GCS 等和Ⅱ相代谢酶基因启动子5’调控区，其具有保守序列5’-(G/A)TGA(G/C)nnnGC(G/A)-3’，在Ⅱ相解毒酶的调控中起重要作用。Keap1-Nrf2 系统在细胞抵御外源性或内源性氧化应激的机制中占有重要地位。研究［3-6］显示，Nrf2 对肿瘤细胞有保护作用，可降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，诱导耐药的产生，Nrf2 缺失和激活障碍与化合物致癌、药物性肝损伤、炎症修复延迟、细胞凋亡等病变过程相关［7］。随着对Keap1-Nrf2 在细胞应激保护、损伤修复等诸多方面认识的深入及作用机制的了解，Keap1-Nrf2 将为抗肿瘤、抗炎症治疗提供新的思路。国内外对于该通路的机制研究尚不充分，为此，作者拟通过检测肺癌组织Keap1-Nrf2/ARE 通路中各蛋白的表达情况，为肺癌发生机制的研究提供线索。

1 材料与方法

1.1 标本来源 在知情同意的情况下，选择郑州大学第一附属医院胸外科住院的肺癌手术患者67例，其中男35例，女32例，年龄30～78(54.9±5.2)岁。肺鳞癌29例，肺腺癌38例;高分化21例，中分化29例，低分化17例。同时选取同例患者癌旁5 cm 的肺组织作为正常对照，癌及癌旁正常组织均经病理学确诊。

1.2 主要仪器与试剂 冷冻切片机(LEICA CM3050S，德国)，兔抗人多克隆一抗(北京博奥森生物技术有限公司)，SP-9001 型免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 肺组织中Keap1、Nrf2、NQO1 蛋白表达的检测 采用免疫组化法。取手术切除的肺组织标本，体积分数10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm 厚切片，一抗按1∶ 100 稀释，按照SP-9001 型免疫组化试剂盒说明书进行操作。应用江苏捷达科技公司图像采集分析系统，在高倍显微镜视野下，每张切片选取阳性细胞集中的视野采集6～10 个图像，利用Image-Pro Plus 6.0 软件对每张图片处理后计算其平均光密度。

1.4 统计学处理 采用SPSS 12.0 处理数据，癌及癌旁组织Keap1、Nrf2 及NQO1 表达水平的比较应用配对样本t 检验，临床病理特征中肿瘤体积、分化程度及临床分期采用单因素方差分析，其他均采用两独立样本t 检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 肺癌及癌旁正常组织中Keap1、Nrf2、NQO1蛋白的表达 与癌旁正常组织比较，肺癌组织中Keap1 蛋白多见于细胞质和细胞核中，呈淡黄色或棕褐色颗粒;Nrf2 蛋白呈淡黄色或棕褐色颗粒，主要定位于细胞核中，散见于细胞质中;NQO1 蛋白在细胞质与细胞核中均有不同程度的表达，呈棕褐色颗粒。见图1。

2.2 肺组织中Keap1、Nrf2 及NQO1 蛋白表达情况 见表1。

图1 正常肺组织(A)与肺癌组织(B)中Keap1、Nrf2、NQO1 蛋白免疫组化检测(SP，×100)

2.3 Keap1、Nrf2 和NQO1 蛋白的表达与肺癌临 床病理特征的关系 见表2。

表1 肺组织中Keap1、Nrf2、NQO1 蛋白表达情况

表2 Keap1、Nrf2 和NQO1 蛋白的表达与肺癌临床病理特征的关系

3 讨论

Nrf2 核转录因子是细胞保护因子，正常生理状态下与胞质蛋白伴侣分子Keap1 结合，其活性处于相对抑制状态。氧化应激条件下，Nrf2 逃脱Keap1的结合抑制，进入细胞核，与ARE 结合，启动ARE调控下游基因的表达，其中包括NQO1。

Padmanabhan 等［8］发现人肺癌细胞株中Keap1的DGR 结构域甘氨酸转变为半胱氨酸，引起构象的改变，导致Nrf2 核内聚集。Singh 等［9］通过对肺癌患者样本和肺癌细胞株中Keap1 基因位点的系统分析，发现Keap1 主要功能区序列出现缺失、插入和错义等基因突变，导致Keap1 功能失活以及Nrf2 的释放，相应地激活了癌组织细胞中Nrf2 介导的基因表达。另外，Nrf2 中Keap1 的结合序列DLG 和ETGE基序中任何一个位点氨基酸密码子发生置换，Keap1对Nrf2 基因的负调控作用都会消失［10］。该研究发现肺癌组织中Keap1 蛋白在各临床分期的表达水平除Ⅱ期腺癌外均明显高于正常组织，推测可能是由于Keap1 发生突变使其功能受损，导致Keap1 不能与Nrf2 相互作用，使Keap1 表达升高; Nrf2 蛋白除Ⅰ期腺癌略高于正常组织外，其他均低于正常组织，与上述文献不同，另外NQO1 蛋白除Ⅱ期腺癌略高于正常组织外，其他也均低于正常组织，推测可能存在其他通路的作用降低了Nrf2 及其调控基因NQO1的表达。同时这3 种蛋白的表达水平与肺癌的临床分期和病理组织学分型有关，提示Keap1-Nrf2/ARE通路在肺癌的发生发展过程中发挥重要的作用。

另有研究［11］发现Keap1 和Nrf2 突变后导致肺癌发生率完全不同，前者在腺癌中常见，后者在鳞癌中常见。存在Nrf2 突变的癌症患者有以下几个特点:①吸烟史发生率较高。②鳞癌发生率较高。该研究结果显示肺癌患者吸烟Keap1 蛋白的表达水平要高于不吸烟者，与上述文献一致，但Keap1 蛋白在各期鳞癌中表达水平要高于腺癌，Nrf2 蛋白仅在Ⅱ期和Ⅲ期鳞癌中表达高于腺癌，推测Keap1、Nrf2 蛋白的异常表达与肺癌的发生发展有关。

［1］周舫，梁守沛，王玉珍，等.肺癌组织中HSP70-1 +190(G/C)多态性对HSP70-1 mRNA 及HSP70 蛋白表达的影响［J］.郑州大学学报:医学版，2011，46(4):514

［2］Lau A，Villeneuve NF，Sun Z，et al.Dual roles of Nrf2 in cancer［J］.Pharmacol Res，2008，58(5/6):262

［3］Wang XJ，Sun Z，Villeneuve NF，et al.Nrf2 enhances resistance of cancer cells to chemotherapeutic drugs，the dark side of Nrf2［J］.Carcinogenesis，2008，29(6):1235

［4］Kim HR，Kim S，Kim EJ，et al.Suppression of Nrf2-driven heme oxygenase-1 enhances the chemosensitivity of lung cancer A549 cells toward cisplatin［J］.Lung Cancer，2008，60(1):47

［5］Kim SK，Yang JW，Kim MR，et al.Increased expression of Nrf2/ARE-dependent anti-oxidant proteins in tamoxifen-resistant breast cancer cells［J］.Free Radic Biol Med，2008，45(4):537

［6］催俣，马海英，孔力.Nrf2/ARE 通路与机体抗氧化机制的研究进展［J］.吉林大学学报:医学版，2011，37(1):187

［7］Taguchi K，Motohashi H，Yamamoto M.Molecular mechanisms of the Keap1-Nrf2 pathway in stress response and cancer evolution［J］.Genes Cells，2011，16:123

［8］Padmanabhan B，Tong KI，Ohta T，et al.Structural basis for defects of Keap1 activity provoked by its point mutations in lung cancer［J］.Mol Cell，2006，21(5):689

［9］Singh A，Misra V，Thimmulappa RK，et al.Dysfunctional KEAP1-NRF2 interaction in non-small-cell lung cancer［J］.PLoS Med，2006，3(10):e420

［10］Hayes JD，McMahon M.NRF2 and KEAP1 mutations:permanent activation of an adaptive response in cancer［J］.Trends Biochem Sci，2009，34(4):176

［11］Shibata T，Ohta T，Tong KI，et al.Cancer related mutations in NRF2 impair its recognition by Keap1-Cul3 E3 ligase and promote malignancy［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(36):13568