HPLC测定肾康口服液中大黄酸、大黄素和大黄酚的含量

秦静海，曹站霞

(河南中医学院第一附属医院，河南郑州 450000)

肾康口服液为我院院内制剂，由大黄、白花蛇舌草、牡蛎、川芎等组成，具有荡涤浊毒、清热活瘀的功效。大黄［1］为其君药，主要活性成分为大黄酸、大黄素、大黄酚等。目前对肾康口服液的质量控制主要依据薄层色谱法来进行定性监测，可该法不能很好地反映其内在真实质量。HPLC能对药品的主要有效成分进行定量监测，是当前的药品质量控制的通用方法。本文拟建立肾康口服液的HPLC方法，为进一步提高肾康口服液质量的稳定性，实现确保临床疗效奠定基础。

1 药品、试剂与仪器

肾康口服液，10 mL/支，制剂号为豫药制字Z04010431，批号 111026，111210，120217;实验药材均取自河南中医学院第一附属医院中药房，经河南中医学院第一附属医院药学部陈天朝主任药师鉴定为正品。大黄酸(批号0757-200206)、大黄素(批号110756-200110)、大黄酚对照品(批号110796-200716)，均由中国药品生物制品检定所提供;甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。Waters 2695高效液相色谱仪，美国沃特世公司产品;色谱柱为Agilent C18(4．6 mm ×150 mm，0．5 μm)，安捷伦科技有限公司产品;Sartorius CP225D电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司提供。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

采用 Agilent C18(4．6 mm ×150 mm，5μm)色谱柱，以甲醇-0．1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱(见表1)，体积流量1．0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长254 nm，进样量20 μL。理论板数按峰计算应不低于3000。

表1 梯度洗脱程序

2．2 对照品溶液的制备

分别精密称取大黄酸、大黄素、大黄酚对照品1．05，0．15，0．13 mg 置于 25 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀即分别得到42．016 mg/L的大黄酸溶液、5．968 mg/L 大黄素溶液和5．200 mg/L大黄酚溶液。

2．3 供试品溶液的制备

精密量取(取前摇匀)各样品2．0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。用0．45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2．4 阴性对照液的制备及干扰试验

按处方取去除大黄的药材，按样品工艺同法制备，制得阴性对照样品，再按供试品溶液的制备方法操作，制成阴性对照溶液。将对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各进样20 μL，按上述色谱条件进样分析，记录色谱图。结果见图1。结果表明：供试品色谱中，与对照品色谱相应位置上，具有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照色谱中无干扰。

图1 肾康口服液对照品及供试品色谱图

2．5 线性关系考察

精密吸取大黄酸、大黄素和大黄酚对照品的混合液 0．5，1．0，2．0，3．0，4．0，5．0 mL，分别置于5 mL容量瓶中;加甲醇稀释至刻度;再精密吸取上述对照品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪中。以对照品质量浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y建立三者的标准曲线。结果：大黄酸标准曲线方程为Y=3 ×106X-5 019．9，r=0．999 8(n=6);大黄素标准曲线方程为 Y=3 ×106X+1 436．9，r=0．999 8(n=6);大黄酚标准曲线方程为Y=5×106X+2 260．8，r=0．999 8(n=6)。表明：大黄酸、大黄素、大黄酚浓度分别在 4．201 6 ～42．016 0 mg/L、0．596 8 ～5．968 0 mg/L、0．52 ～5．20 mg/L 范围内与峰面积呈良好线性关系。

2．6 精密度试验

取大黄酸、大黄素、大黄酚混合对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积，大黄酸、大黄素、大黄酚RSD 值分别为0．44%，1．31%，1．35%。结果表明：精密度良好。

2．7 重复性试验

取同一供试品溶液，按供试品溶液制备方法平行处理6份，依法测定，大黄酸、大黄素、大黄酚峰面积 RSD 值分别为 0．30%，2．26%，2．12%。结果表明：重复性良好。

2．8 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别于制备后0，2，4，8，12，48 h 各进样 1 次，大黄酸、大黄素、大黄酚RSD 值分别为1．21%，2．43%，2．59%。结果表明：供试品溶液中大黄酸、大黄素、大黄酚含量在48 h内稳定性较好。

2．9 加样回收率试验

取已知大黄酸、大黄素、大黄酚含量的样品溶液6份，分别精密加入对照品溶液适量，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按样品测定方法测大黄酸、大黄素、大黄酚含量。结果：大黄酸平均回收率为102．59%，RSD值为1．06%;大黄素平均回收率为99．90%，RSD值为2．85%;大黄酚平均回收率为100．41%，RSD 值为1．89%。见表2～4。

表3 大黄素加样回收率试验结果

表4 大黄酚加样回收率试验结果

2．10 样品含量测定

按上述方法，制备供试品溶液，测定3批肾康口服液中大黄酸、大黄素、大黄酚的含量，结果见表5。

表5 3批样品中大黄酸、大黄素和大黄酚含量测定结果 mg·L-1

3 讨论

本实验最初采用2010版《中药药典》一部大黄项下甲醇-磷酸水溶液等度洗脱的方法，但色谱峰有重叠、拖尾的现象，不能得到良好的分离效果。经过试验，采用梯度洗脱的方法，达到了良好的分离。本实验通过对肾康口服液HPLC的方法学考察得出：本试验条件用于肾康口服液中大黄酸、大黄素、大黄酚的含量测定，方法稳定、可靠，可作为控制本品质量的有效方法。

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典：一部［M］．北京：中国医药科技出版社，2010：22．

［2］高学敏．中药学［M］．北京：中国中医药出版社，2007：158．