真核质粒在组织细胞内的表达时效

胡伊乐，郭绍芳，涂心明

在治疗一些因基因缺陷造成的先天性疾病时，传统的化学药物治疗不能取得良好的效果，寻求一种新的治疗方法成为研究的热点。随着分子生物学的发展，生命科学许多领域的研究都发生了质的飞跃[1]。基因克隆、测序、基因表达等分子生物学研究方法的日臻成熟, 为转基因技术的产生奠定了基础，也为这些疾病的治疗提供了一种新的方法。在基因治疗中以真核载体为代表的非病毒载体以其制备方便、低毒、低免疫反应等优势越来越多地被应用于临床与科研中[2]。真核载体由于不整合入机体细胞基因组，随着细胞的分裂与增殖其表达能力逐渐衰减，需要不断有新的外源性基因补充。本试验通过对PCDNA3.1(+)-EGFP、pEGFP-C3、pIRES-GFP 3种绿色荧光真核质粒转染细胞后在细胞内的表达时间，并将前脑啡肽原基因连接到pEGFP-C3、pIRES-GFP上使其在细胞内表达，根据细胞上清液放免结果推断出真核载体的表达时效，为基因治疗的给药间隔提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验材料胎牛血清、DMEM培养基购自Hyclone公司；PCDNA3.1(+)-EGFP、pEGFP-C3、pIRES-GFP绿色荧光载体由河南科技大学医学院人体解剖学实验室保存；NIH3T3细胞来自河南省农科院；6孔细胞培养板、冻存管购自上海宝生物有限公司；RT-PCR试剂盒、质粒小提试剂盒、G418购自郑州天根生物有限公司；亮氨酸脑啡肽(L-ENK)放免试剂盒购置于第二军医大学神经生物学研究所。

1.2绿色荧光载体-PENK载体的构建取大鼠脑组织液氮冷冻后研碎，提取脑组织总RNA。设计并制备两端加上相应酶切位点的引物，逆转录获单链cDNA，PCR扩增大鼠前脑啡肽原基因PENK。将获取的大鼠前脑啡肽原基因双酶切，连接到pEGFP-C3、pIRES-GFP绿色荧光载体上获得pEGFP-C3-PENK、pIRES-GFP-PENK重组载体。

1.3体外细胞转染实验与检测解冻NIH3T3细胞并传代3次以保证细胞活性的恢复，转入6孔培养板待细胞铺满培养皿底部达75%时，按脂质体2000说明书操作步骤将PCDNA3.1(+)-EGFP重组质粒pEGFP-C3-PENK、pIRES-GFP-PENK与NIH3T3细胞按比例混合继续细胞培养。

1.4阳性细胞的观察与统计细胞转染后24 h换含有胎牛血清的培养基继续培养，并观察其转染效果、48 h时进行换液并观察细胞绿色荧光的表达，此后每隔48 h在倒置荧光显微镜下观察转染效果，每孔在40倍视野下随即选取6个视野，记录每个视野中显示绿色荧光的阳性细胞的数量，将6视野细胞数求和并进行统计学分析。

1.5细胞上清液放免测定由于脑啡肽容易被降解，为保证放免结果的准确性，每次观察细胞时取0.5 mL细胞上清液，迅速置95℃水浴锅中使其固定保存。利用亮氨酸脑啡肽放免试剂盒测定细胞上清液中脑啡肽的浓度。

2 结果

2.1细胞绿色荧光的表达转染3种真核质粒的细胞绿色荧光的表达见图1。

图1 48 h时3种真核质粒在细胞中的表达

2.2阳性细胞表达数量3种质粒转染细胞后阳性细胞在40倍视野下随机选取6个视野之和见图2，绿色荧光阳性细胞数量在48 h时达高峰，持续表达35 d后开始下降。

图2 3种质粒阳性细胞数量

图3 细胞上清液放免检测结果

2.3细胞上清液放免检测结果pEGFP-C3-PENK, pIRES-GFP-sPENK重组质粒转染细胞后上清液放免检测结果显示48 h达高峰(852.37±76.82)pg/mL,稳定表达32 d后开始衰减，变化规律与细胞荧光表达基本符合。动态表达见图3。

3 讨论

基因治疗是随着分子生物学与细胞生物学技术的发展而产生的一种新型治疗方法，它将外源性治疗基因片段连接到某种载体上，转入机体细胞内表达，以弥补先天性基因缺陷或不足，从而起到治疗作用[3]。1990年在美国成功进行了ADA(腺苷脱氨酶) 缺陷患儿的人体基因治疗，开创了基因治疗在临床上应用的先河。此后基因诊断与治疗的研究在科研与临床上得到广泛的应用。常用的基因治疗方法包括基因补偿、基因纠正、基因代偿、反义技术等。在基因治疗中目前常用的载体多为病毒性载体，该载体虽有良好的细胞转染率与染色体整合能力，但其自身存在可控性差、自身免疫原性和潜在的致癌性等缺陷限制了其应用[4]。真核载体外源基因整合率低，且具有低毒、低免疫原性等优点日益得到广泛关注。但真核载体携带的目的基因由于没有整合入细胞自身基因组，不具有随着细胞的分裂而增殖的能力，其在细胞内的表达能力将随细胞的增殖逐渐衰减，这决定了它们在机体内的表达具有一定的表达时效。为验证真核载体在细胞内的表达时效，为今后的临床与试验研究提供理论依据，本试验选用3种目前常用的3种绿色荧光真核载体转染机体细胞，通过细胞内绿色荧光的表达推定真核载体表达的时效，同时在pEGFP-C3、pIRES-GFP载体上连接前脑啡肽原基因，使其在细胞内合成亮氨酸脑啡肽(L-ENK)。由于L-ENK结构小，可以自由出入细胞膜，在体外细胞培养实验中，通过放免法检测细胞上清液中L-ENK的浓度，观察外源基因在细胞内的动态表达，进一步验证绿色荧光蛋白的表达结果。实验结果显示3种绿色荧光载体在转染NIN3T3细胞24 h后即开始表达，在36 h即达到高峰，随后一直持续高表达，在35 d后其表达开始衰减，可一直持续2个月以上。L-ENK放免测定结果显示48 h时达高峰, 稳定表达32 d后开始衰减，变化规律与细胞荧光表达结果基本符合。根据试验结果可得出以下结论：在基因治疗中真核质粒连接目的基因能在机体细胞内稳定表达约35 d，外源基因补充间隔选定为30 d较为合适。

参考文献：

[1] Lee ES,Kim D,Youn YS,et al.A virus-mimetic nanogel vehicle[J].Angew Chem Int Ed Engl, 2008, 47(13): 2418-2421.

[2] 胡伊乐，曹靖，任秀华,等. pEGFP-C3-PENK/NIH3T3表达的脑啡肽对神经细胞PKA表达的影响[J]. 郑州大学学报(医学版),2010,45(2):269-272.

[3] Rizzi A,Spagnolo B,Wainford RD,et al.In vitro and in vivo studies on UFP-112, a novel potent and long lasting agonist selective for the nociceptin/orphanin FQ receptor[J].Peptides, 2007, 28(6):1240-1251.

[4] Smith RR,Martin-Schild S,Kastin AJ,et al.Decreases in endomorphin-2-like immunoreactivity concomitant with chronic pain after nerve injury[J].Neurosc,2001, 105(3):773-778.