应用脂肪干细胞构建小口径组织工程血管平滑肌层的实验研究

崔 磊，雷万军，杨建英

血管组织的缺损是临床上常见的外科疾病之一。目前临床上大多采用自体移植、异体移植以及人工合成替代品移植技术来修复这些缺损，但这些方法各有其缺点，很难满足临床上血管缺损修复的需要[1-2]。组织工程学的产生为血管病变的修复提供了一种新的途径。由于脂肪干细胞(adipose derived stem cell，ASCs)具有来源广泛、取材方便、对供体损伤小、体外增殖能力强且不受年龄的影响等特点[3-4]，而备受人们的关注，用作组织工程血管构建的种子细胞。同时，我们的前期实验也证明，在应用能模拟体内血流循环、血管搏动的装置—血管生物反应器的作用下，可以产生具有一定力学强度的组织工程化血管平滑肌层[5-6]。本实验就在此研究的基础上，应用人ASCs作为种子细胞，在转化生长因子(TGF-β1)和骨形态发生蛋白4(BMP4)的作用下，向平滑肌细胞诱导分化，并应用生物反应器在体外构建组织工程化血管组织。

1 材料和方法

1.1人脂肪干细胞(hASC)的分离、培养脂肪组织来源于上海第九人民医院整复外科脂肪抽吸术患者，均为女性，平均年龄30岁。根据Zuk[7]的方法进行，简言之：无菌PBS冲洗脂肪，用0.075%I型胶原酶(Sigma-Aldrich)在37℃摇床中消化60 min后，加同体积含10%FBS (Gibco公司)的低糖DMEM培养液终止消化，1 200 g离心10 min，小心吸除上层脂肪油层和大部分上清，50 μm滤网过滤离心成分，再600 g离心10 min，去除上清，用含10%FBS的LG-DMEM培养液重悬细胞，以4.0×104细胞/cm2接种于直径100 mm培养皿中，24 h后去除非贴壁细胞，之后每隔3 d换液，细胞达80%～90%融合时，常规传代，第4～6代的细胞用于以下实验。

1.2人脂肪干细胞(hASC)向平滑肌细胞的诱导分化当hASCs达50%～60%融合时，分不同组加入如下不同的培养液进行诱导观察：①LG-DMEM+10%FBS(正常培养液)， ②LG-DMEM+1%FBS(BM)，③LG-DMEM+1%FBS+5 ng/mlTGF-β1(R&DSystems)，④LG-DMEM+1%FBS+2.5 ng/mL BMP4(R&DSystems)，⑤LG-DMEM+1%FBS+2.5 ng/mLBMP4+5 ng/mLTGF-β1。人脐动脉平滑肌细胞(hUASMCs)作为阳性对照。每2 d换液1次，共诱导7 d。

1.3细胞生长曲线的检测将在上述不同培养液中的细胞分1、3、5、7和10 d 5个时间点以DNA定量的方法进行计数。即以0.5 mg/mL的蛋白酶K溶解消化细胞，每孔0.5 mL，56℃过夜。离心(1 200 r/min)后洗去40 μL上清与160 μL Hoechst33258染液混合，移入黑色平底96孔板中，避光37℃孵化20 min，以全波段酶标仪检测360 nm荧光强度(激发光波长465 nm)。并以相同方法检测确定细胞数的DNA的360 nm荧光强度，绘制标准曲线，根据标准曲线和检测荧光值得出所测样本的细胞数。

1.4免疫荧光检测用乙醇∶冰醋酸(99∶1)固定细胞或组织切片15min，PBS漂洗；10%羊血清封闭30 min；加适当稀释的一抗：鼠单克隆抗α-SMA(Sigma-Aldrich)、SM-MHC (Sigma-Aldrich)，兔多克隆抗SM22α (Abcam)和兔单克隆抗calponin (Abcam)， 4℃过夜；PBS漂洗，滴加FITC标记的相应二抗，37℃孵育45 min，PBS漂洗；碘化丙啶(PI)衬核后，荧光显微镜下观察。以脐动脉平滑肌细胞为阳性对照。

1.5 RT-PCR检测用Trizol提取不同条件下诱导7 d的细胞内总RNA，进行逆转录反应，然后进行PCR扩增检测平滑肌特异性标记物α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC的表达，反应条件：95℃ 3 min变性，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，35个循环，72℃延伸10 min。引物序列如表1。

表1 RT-PCR反应引物序列

1.6 Western-blotting检测用细胞裂解缓冲液裂解细胞或组织，获取蛋白，将蛋白与2×上样缓冲液混合后，SDS-PAGE电泳，然后转移至PVDF膜上，将印迹后的PVDF膜用甲醇浸泡，加入封闭液(5%BSA，TBST),4°C封闭过夜。各一抗和β-actin加入膜上，4℃过夜，吸去一抗，加入IRDye 700 DX或IRDye 800 CW标记的二抗，以Odyssey红外图像成像系统扫描成像，β-actin的表达作为各组细胞的内参。

1.7 PGA膜片的制备及细胞-PGA复合物的体外培养将50 mg未编织的PGA纤维制作成55 mm×45 mm×2 mm大小的膜片，75%乙醇浸泡1 h ，紫外光照射30 min，用标准DMEM液浸泡过夜。收集hASCs 5×107细胞/mL，将1mL的细胞悬液接种于PGA材料上，置于37℃、5%CO2培养箱内，黏附4 h后加入诱导液，体外培养皿中培养7 d，取细胞-PGA复合物同时做扫描电镜观察和DiO标记细胞后的激光共聚焦显微镜观察细胞在材料上的黏附情况。

1.8细胞-PGA复合物在生物反应器内的动态培养1周后，将细胞-PGA复合物卷裹于反应器反应槽内的无菌硅胶管上(内径4 mm)，并用无菌可吸收缝线固定。动态组：将其接于动态槽内接口，予以动态力学刺激，参数设定为：搏动频率75次/min，扩张量<5%，流量为70～80 mL/min至100～120 mL/min，压力为0.01～0.02 mPa。每周换液1次，共培养8周。

1.9组织学检测常规石蜡切片，分别做H&E染色、Masson三色染色和Gomori醛复红染色观察新生管样组织的组织学特点、胶原分泌情况和弹性纤维的合成情况。

1.10生物力学检测用INSTRON力学测定仪对构建的组织的最大张力、弹性模量和缝线张力进行测定。

1.11组织工程化血管胶原含量的测定将构建的组织称重，并用10∶1比例的胃蛋白酶进行消化，振荡过夜，根据Sircol Soluble Collagen Assay试剂盒，用分光光度仪测量540 nm处的光密度值，根据标准曲线测定测定组织中总胶原的含量，用μg/g 湿重表示。

1.12统计学分析所有结果均采用均数±标准差表示，采用SPSS 11.0统计软件(Student’st检验)进行统计学分析，当P<0.05 时，具有统计学意义。

2 结果

2.1细胞形态观察hASC在正常培养液培养下细胞呈成纤维样梭形生长(图1a)，在单纯低血清培养液(BM)中呈扁平样生长(图1b)，而在含有TGF-β1和/或BMP4的诱导液的作用下，细胞呈梭形生长，与hUASMCs的生长形态相似，呈平滑肌细胞特有的“波峰—波谷”样生长模式(图1c～f)。其中尤其在TGF-β1和BMP4的联合诱导作用下细胞形态变化更明显，Phalloidin 染色(图1)也显示了细胞内的肌丝与hUASMCs一致。

a:正常培养液中第5代hASCs的生长形态 b:无生长因子的低血清培养液培养7 d c:单纯TGF-β1诱导组 d:单纯BMP4诱导组 e:TGF-β1和BMP4联合诱导组 f:阳性对照hUASMCs组(标尺大小：a～f：100 μm,其中插图标尺大小：50 μm)。

2.2细胞生长曲线从图2的生长曲线可以看出，hASCs在正常培养液中持续生长，而在其他组，无论是单纯的低血清诱导组还是加有生长因子的诱导组，细胞都出现了生长停滞，说明hASCs的生长活性良好。同时，在加有生长因子的情况下，细胞生长停滞有利于细胞向平滑肌细胞分化。

2.3 hASCs在TGF-β1和BMP4的作用下平滑肌细胞特异性标记物的表达免疫荧光检测可以看出，hASCs在TGF-β1和BMP4的联合诱导作用下，表达平滑肌细胞的特异性蛋白：α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC。而在正常培养液组尽管可见α-SMA、SM22α的基础表达，但在生长因子的作用下，这两个标记物的表达有明显的提高，且只有在联合诱导下，才有SM-MHC的表达，这一标记物只在平滑肌细胞中表达，从而证明在TGF-β1和BMP4的联合作用下，hASCs分化成平滑肌样细胞(图3)。为了证明免疫荧光染色的结果，我们做了western-blot来观察上述指标在蛋白水平的表达情况，从图4A 可以看出，α-SMA、SM22α在正常培养液和单纯低血清组也有一定的表达，但只有在TGF-β1和BMP4的联合诱导组，这些特异性蛋白的表达才与阳性对照组相当。这与荧光观察的结果一样。同时，为了进一步证明TGF-β1和BMP4对hASCs的诱导分化作用，我们又做了RT-PCR来检测这些平滑肌细胞相关基因在转录水平的表达情况。从图4B可以看出，未分化的hASCs 只表达低水平的α-SMA、SM22α mRNA、TGF-β1或BMP4，单纯诱导组可见calponin的表达，而只有两者联合作用组才见SM-MHC的表达且与阳性对照组相似。从而在蛋白和转录水平证明了在TGF-β1和BMP4的联合作用下，hASCs分化成了平滑肌细胞。

A:不同组细胞生长的形态变化 B:DNA定量法(Hoechst 33258染色)检测hASCs在不同培养液中的增殖曲线

可见只有在TGF-β1和BMP4的联合诱导作用下，诱导细胞才表达与hUASMCS相似的细胞骨架蛋白(绿色)，PI衬细胞核(红色)。标尺大小：25 μm，插图：50 μm。

图3 免疫荧光染色观察hASCs在不同培养条件下作用7 d表达平滑肌细胞特异性蛋白(α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC)的情况

A:Western-blot分析α-SMA, SM22α、Calponin、SM-MHC和β-actin的表达 B:RT-PCR观察各蛋白的mRNA的表达

2.4细胞-PGA复合物的体外及生物反应器内培养细胞-PGA复合物在体外培养7 d，电镜和激光共聚焦可见大量细胞黏附于材料上，并有大量的细胞外基质分泌充填于PGA纤维间，且细胞分布于PGA膜片的各个部位 (图5a～d)。随着复合物在反应器内的培养，PGA材料逐渐降解，形成管样组织(图5e)。培养8周后，形成新生的组织工程化肌管组织。新生组织色泽光亮，质地均匀，管腔圆润，具有一定的弹性和强度(图5f)。

2.5组织学观察反应器内培养8周后，HE染色可见构建组织结构致密，平滑肌纤维排列规则，分布较均匀，PGA纤维已基本降解。Masson染色可见胶原分泌旺盛且浓密，肌纤维排列整齐，细胞分布规则，PGA已降解完全。但是未见弹性纤维的结构出现(图6A)。同时我们对构建的组织进行免疫组化分析，可以看出细胞在反应器内培养8周后仍然表达平滑肌细胞的标记物，细胞分布均匀规则(图6B)。

a:PGA支架材料大体观 b:扫描电镜观察7 d时，PGA材料上有大量细胞黏附并伴细胞外基质分泌，箭头指示分泌的基质。插图示倒置相差显微镜观察7 d时细胞-PGA复合物，细胞材料黏附紧密，细胞外基质分泌增多 c:DiO标记的细胞接种至PGA支架材料上7 d的黏附情况 d:激光扫描共聚焦显微镜观察有大量DiO标记的平滑肌样细胞分布于PGA纤维上，且有丰富的细胞外基质分泌其中，插图示横断面情况 e～f:随着细胞-PGA复合物在反应器内的培养，PGA逐渐降解，形成管样组织

2.6胶原定量和生物力学检测反应器内培养8周构建组织的胶原含量达(48.4±6.65) μg/g湿重，而正常的人大隐静脉的胶原含量为(78.15±5.57)μg/g湿重，达到正常血管的60%。将构建的组织沿环状面切开，根据应力—应变曲线可以看出：反应器内力学动态培养构建组织的最大张力达0.63×106Pa，达到了正常人大隐静脉的65%。8周后，构建组织的缝线张力达(0.93±0.04) N，达到正常大隐静脉的56%(表2)。以上结果说明在生物反应器内力学刺激的培养下，所构建的管样组织力学强度达到了正常大隐静脉的近60%。

3 讨论

随着自体血管移植技术的发展，尤其是人工合成血管(如Dacron、ePTFE等)制备技术的不断提升，使临床修复直径大于6 mm血管的成功率大大提高。但是对于直径小于6 mm的小口径血管由于缺乏内皮覆盖,易发生血栓，造成血管堵塞。组织工程技术的出现为解决小口径血管重建的难题提供了可能。但由于种子细胞来源不足而造成其很难很快进入临床应用。本实验证明在TGF-β1和BMP4的联合诱导作用下，hASCs获得了平滑肌细胞的形态，并且表达平滑肌细胞的特异性标记物α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC。同时我们的前期试验还表明诱导后的细胞接种于胶原凝胶上出现和正常成熟平滑肌细胞一样的收缩反应。说明hASCs可作为种子细胞用于构建组织工程化血管。

A:构建组织(a、c、e)和人脐动脉(b、d、f)，其中a～b为H&E染色，c～d为Masson三色染色，e～f为Gomori醛复红染色。箭头示弹性纤维，标尺长度：100 μm B:免疫组化检测反应器内培养培养8周的组织表达α-SMA和calponin的情况，标尺长度：50 μm

为了使构建的组织获得理想的力学强度，必须使接种的材料有合适的降解速率，本实验使用PGA作为支架材料，因为它具有良好的生物相容性，Niklason等[8]就是应用PGA构建了第一个自体血管移植物并回植体内的。同时，我们也在前期研究中应用PGA和成熟平滑肌细胞成功构建了大口径血管壁组织。但是，本实验应用的PGA膜片支架是手工编织的，容易造成PGA纤维的分布不均，从而造成细胞分布不均，构建的组织薄厚不均，影响最终的力学强度。因此，有待改进技术以提高PGA膜片支架的一致性、均一性。

研究表明循环张力可以明显提高构建血管组织的力学强度，降低细胞的程序性死亡[9]，促进细胞的定向排布，增加胶原含量，防止平滑肌细胞的表型改变[10]，从而增加平滑肌细胞的收缩特性。本实验的结果显示，在生物反应器内动态刺激下所构建的组织工程化平滑肌层组织学结构层次清晰，结构致密，胶原含量明显增加，同时，在动态力学的刺激下，新生组织细胞分布有序，胶原浓密，排列规则。说明适宜的力学刺激有利于血管组织的形成和细胞适应性再塑。这一观察结果与Seliktar的报道[11]相一致，他们认为循环张力通过过度表达金属蛋白酶-2以提高基质的重塑。同时我们观察到，诱导的hASCs在没有生长因子的作用下在生物反应器内动态培养8周仍能维持平滑肌细胞的表型。

表2 构建组织的生物力学检测结果，与人大隐静脉(HSV)作比较

本实验中应用的生物反应器，主要模拟了血管承受的双轴张力，即细胞横断面上的同向张力和轴向张力。而对于血管承受的流体剪切应力，即流动的血液顺血流方向作用于腔侧血管内皮细胞单位面积上的力，尚无法模拟。因此，应进一步完善生物反应器的结构，使之能模拟立体剪切应力作用，以使之能更完全模拟体内流体作用的环境。

血管的生长发育是一个缓慢而复杂的过程，其生物力学性能也是随着血管的不断生长在血流的不断作用下而逐渐提高的，体外生物反应器只是给予细胞—生物材料一个更接近的生长环境，其最终的目的是要回植到体内，用于血管缺损的修复。而体内的大环境才是血管生长成熟的最佳环境，体内的血流刺激才是最有效的作用因素。下一步可考虑接种上内皮细胞，回植体内，在血流的作用下，使其进一步生长发育。从而构建出更符合生理功能的血管组织。

本实验结果表明hASCs在TGF-β1和BMP4的作用下可诱导分化为平滑肌细胞，并且诱导的细胞可在三维PGA支架上保持平滑肌细胞的表型。同时将其接种于PGA支架材料上，可在生物反应器内形成具有一定强度的小口径血管组织(内径4 mm)。另外此方法还可以用以构建其他小口径的肌管组织如输尿管、胆囊管和卵巢管等。

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