壁虎粗多肽对3种消化道肿瘤细胞的体外抑制作用

王建刚，钱 昕，宋 莹，刘 玲，席守民，崔朝初

目前，消化道肿瘤的治疗仍是以手术为主的综合性治疗，运用中药材治疗恶性肿瘤是临床研究的重要课题。近年来我国用中西医综合治疗的原则,使癌症患者生存率显著提高[1]。壁虎是我国传统的治疗肿瘤的中药材，大量临床和基础研究表明壁虎确有抗肿瘤作用，特别对消化道肿瘤作用显著[2-3]。本实验对壁虎有效成分进行分离纯化，得到壁虎粗多肽(gecko crude peptides，GCPS)，并研究其对消化道肿瘤细胞的体外增殖抑制作用。

1 材料和方法

1.1药物和仪器壁虎来源：中药壁虎购自河北保定安国市光明饮片加工厂有限公司(批号090301)，经鉴定为多疣壁虎(Gecko japonicus)；细胞株：食管癌细胞EC109，肝癌细胞HepG2和胃癌细胞MGC803均由中国药科大学馈赠；仪器与试剂：二氧化碳培养箱(日本Sanyo公司)，倒置显微镜GZX-DH-40×45型(德国Leica公司)，超净工作台SP2DJ22B型(浙江金坛市荣华仪器制造有限公司)，ELx800酶标仪(美国Bio-Tek公司)，AL104电子天平(瑞士梅特勒托利多公司)，L50胶体磨(上海诺尼公司)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器公司)，3 500KD透析袋(美国Amresco公司)，冷冻干燥仪(德国MartinChrist公司)，96孔、6孔培养板(美国Costar公司)，实验用其他试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1 GCPS的提取 干壁虎1 000 g粉碎为粗粉，置于4 000 mL Tris-HCl缓冲液中(pH=7.4)，浸泡过夜，胶体磨破碎细胞，离心2次(11 000 r/min，20 min)，取上清，加无水乙醇至终浓度为55%，放4℃冰箱中，每30 min搅拌1次，4 h后离心1次(11 000 r/min，20 min)，取上清，真空旋转蒸发回收乙醇，经盐溶盐析，透析得到的多肽即GCPS。

1.2.2 MTT法检测GCPS的体外抗肿瘤作用 将RPMI1640培养基培养的食管癌细胞EC109、肝癌细胞HepG2和胃癌细胞MGC803分别接每孔1×104/mL接种于96孔板, 用不同浓度 (0.375、0.75、1.0、1.5、3.0 mg/mL) 的GCPS,处理24、48、72 h,结束前4 h每孔加入新鲜配制5 mg/mL MTT 液20 mL，继续培养4 h,弃去培养基, 每孔加入二甲基亚砜 (DMSO) 150 μL，待完全溶解后, 酶标仪测定490 nm 波长处各孔的吸光度A，并按下式计算抑制率。抑制率(%) = [1-(实验组A×阴性对照组A)] ×100%。

2 结果

2.1细胞形态变化实验中用倒置显微镜观察对照组细胞均形态饱满、增殖迅速、成簇正常生长样贴壁生长良好, 形态呈多角形或短梭形, 胞核圆形或椭圆形, 核仁多为2～ 3个, 胞浆透亮；24 h时，1.5 mg/mLGCPS作用的3种消化道肿瘤细胞虽仍有大量增殖，但均出现皱缩变圆的形态；48 h时，1.0 mg/mL的GCPS作用的3种消化道肿瘤细胞胞体变小、变圆,贴壁细胞数目减少, 胞浆透亮度下降, 颗粒感增强,部分细胞胞突回缩变圆,脱落呈悬浮状,细胞膜崩溃,可见细胞碎片；72 h时，以上细胞改变更为明显。

2.2 GCPS对食管癌细胞EC109增殖的影响与对照组比较, 0.375、0.75、1.0、1.5、3.0 mg/mL GCPS能够显著抑制EC109细胞的生长(P<0.01或P<0.05) ，抑制作用随浓度、时间的增加而不断加强,呈一定剂量和时间依赖性。24 h时3 mg/mL、1.5 mg/mL的GCPS对EC109细胞的增殖抑制作用明显(P<0.01)；作用48、72 h时所有剂量的GCPS对EC109细胞的增殖抑制作用特别明显(P<0.01)。3.0 mg/mL的GCPS各个时段对EC109细胞的增殖抑制作用与5-FU药物组比较差异无显著性，结果见表1。

表1 不同浓度GCPS对食管癌细胞EC109的增殖抑制作用

①与对照组相比P<0.05，②与对照组相比P<0.01，③与氟尿嘧啶组相比P<0.05

2.3 GCPS对肝癌细胞HepG2增殖的影响0.75～3.0 mg/mL浓度的GCPS在24、48、72 h能显著抑制HepG2细胞的增殖，其抑制效应呈剂量和时间依赖性，提示壁虎粗多肽体外能够抑制HepG2细胞的增殖，具有抗肿瘤活性。结果见表2。

表2 不同浓度GCPS对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用

①与对照组相比P<0.05，②与对照组相比P<0.01，③与氟尿嘧啶组相比P<0.05

2.4 GCPS对胃癌细胞MGC803增殖的影响与对照组比较,0.75～3.0 mg/mL GCPS能够显著抑制MGC803细胞的生长(P<0.01或P<0.05)，其抑制作用随浓度、时间的增加而不断加强,呈一定剂量和时间依赖性。作用24 h时1.0～3.0 mg/mL的GCPS对MGC803细胞的增殖抑制作用明显(P<0.01)；作用48、72 h时所有剂量的GCPS对MGC803细胞的增殖抑制作用明显(P<0.01)。结果见表3。

表3 不同浓度GCPS对胃癌细胞MGC803的增殖抑制作用

①与对照组相比P<0.05，②与对照组相比P<0.01，③与氟尿嘧啶组相比P<0.05

2.5 GCPS作用于3种细胞的比较如图1A所示，GCPS作用24 h时，对食管癌细胞EC109、肝癌细胞HepG2和胃癌细胞MGC803都具有增殖抑制作用，IC50分别为2.0 mg/mL、2.3 mg/mL和2.8 mg/mL；如图1B所示，GCPS作用72 h时，3种细胞的IC50分别为1.1、1.2、1.4 mg/mL；如图1C所示，GCPS作用72 h时，3种细胞的IC50分别为0.4、0.6、0.8 mg/mL，由线性图分析可知，随着时间的延长GCPS对3种消化道肿瘤细胞的增殖抑制作用增强。

图1 GCPS对3种消化道肿瘤细胞作用比较

3 讨论

临床经验及实验研究结果表明，壁虎具有肯定的抗肿瘤作用，并且在实体瘤治疗方面有良好的应用前景[1-3]。目前各相关研究均对壁虎提取物成分做了初步分析，提出了可能的有效成分。然而迄今为止，壁虎提取物抗肿瘤有效成分仍未明了。壁虎多糖体外抗肿瘤作用明显，但实验证明体内作用不明显[4]；杨丽华、杨金霞等提出是大分子蛋白在发挥作用，但李耀辉等根据研究结果认为并非如此[5]；李钦青等研究了壁虎小分子肽的抗肿瘤作用，但其小分子肽的来源主要是人为酶解的产物[6]。我们课题组已经进行了一些前期研究，采用血清药理学的研究方法，发现干壁虎粉末可以抑制食道肿瘤细胞(EC9706,EC109)的生长增殖，并能显著抑制小鼠S180肉瘤的增殖[7]。进一步验证和解释了壁虎对消化道肿瘤的特殊疗效。用壁虎醇提物对食道癌细胞、肝癌细胞也进行了研究，发现壁虎醇提物也有明显的抗肿瘤作用[8-10]。

经初步分析壁虎醇提物仍然含有多糖类、蛋白质(或多肽和氨基酸)、脂肪类和其他极性较强的物质。大分子蛋白质由于在乙醇的作用下大多沉淀，在醇提物中的分子量不很大，而含有较多的多肽和氨基酸。多肽分子具有广泛生物活性, 同时具有分子量小、制备容易、纯度高、抗原性弱、功能较明确、特异性强、毒副作用小、易于多途径吸收等大分子蛋白不可比拟的优点[11]。本实验中我们用低浓度硫酸铵首先对壁虎醇提物中多肽进行溶解，继而用高浓度硫酸铵使多肽析出，再用半透膜透析使硫酸铵盐和其他小分子物质除掉，从而得到多肽类物质即GCPS。用硫酸铵盐溶盐析在一定条件下不会使蛋白质变性，为此GCPS保持了抗癌活性。实验中，以3种常见的消化道肿瘤细胞即人食管癌细胞EC109、人肝癌细胞HepG2和人胃癌细胞MGC803为模型，用倒置显微镜观察细胞形态变化、用MTT法比较药物的抑瘤率，从而了解GCPS对消化道肿瘤细胞的作用。结果显示GCPS具有明显的抗以上3种消化道肿瘤作用，且呈量效关系和时间依赖性。比较GCPS对食管癌细胞EC109、肝癌细胞HepG2、胃癌细胞MGC803的作用，其作用48 h的IC50分别为1.1、1.2、1.4 mg/mL，作用72 h的IC50分别为0.4、 0.6、 0.8 mg/mL，由此看出GCPS对食管癌细胞EC109的作用较肝癌细胞HepG2和胃癌细胞MGC803的增殖抑制作用明显，但统计学上差异无显著性。

本研究证明了GCPS对3种消化道肿瘤细胞在体外有明显作用。这3种消化道肿瘤细胞在肿瘤发生中占有重要地位。食管癌是世界一些国家和地区常见的恶性肿瘤。中国是世界上食管癌的高发国家，也是世界上食管癌高死亡率的国家之一，年平均死亡率为1.3～90.9/10万，而世界人口标化死亡率为2.7～110.6/10万。肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约60万，居恶性肿瘤的第5位。目前我国发病人数约占全球的半数以上，占全球肝癌病人的55%，已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手。胃癌也是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位[12]。这些肿瘤目前药物治疗效果不佳，研究开发治疗这些常见恶性肿瘤的药物很有必要，因此对GCPS研究具有重要的意义。抗肿瘤多肽主要通过下列机制发挥作用[13]:①提高自身免疫水平，激活细胞免疫、体液免疫; 通过人工模拟抗原结合肽，刺激免疫活性细胞，促进其分化成熟，提高免疫细胞的活性和数量，从而增强自身抗肿瘤的能力。②直接杀伤肿瘤细胞，或阻断肿瘤细胞特殊的信号途径诱导其凋亡。③抑制肿瘤新生血管的生成。GCPS如何发挥其抗肿瘤作用，有待进一步研究。

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