miR-124对人成骨肉瘤MG-63细胞生长增殖的影响

唐志斌，廖 瑛

（南华大学第一附属医院骨外科，湖南 衡阳 421001）

microRNA是近年来发现于真核细胞中的一类内源性非编码小分子RNA，它在调控基因的转录和蛋白翻译中发挥重要的作用，是近年来生命科学的研究热点，人类miRNA通过调控其靶基因的表达及相关信号通路，在肿瘤的发生、发展和转归过程中发挥重要作用［1］。研究表明，miR-124在宫颈癌和肝癌组织中表达下调，miR-124可通过靶向ITGB1抑制口腔鳞状细胞癌的生长，也可通过靶向CDK6抑制髓母细胞瘤细胞的生长与浸润［2-5］。本文采用MTT检测miR-124对人成骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响，为进一步阐明成骨肉瘤发生发展的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系

MG-63细胞为人成骨肉瘤细胞系，购自北京协和细胞生物所。MG-63细胞培养于含15%小牛血清的MEM培养基（Gibco公司）。

1.1.2 试剂

MTT为Sigma产品；脂质体2000购自Invitrogen公司；miR-124模拟物与抑制剂购自上海吉玛生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

MG-63细胞常规培养，选择对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 细胞转染

1×104细胞于96孔板中，完全培养基中细胞生长至30%汇合期。加入2.5μL的脂质体于100μL无血清培养基中混匀静置15min，稀释12.5pmol的miR-124模拟物或抑制剂于50μL无血清培养基中，混合上述脂质体与DNA稀释液，室温放置30min；分别用PBS与无血清培养基洗涤细胞；将上述混合物加入96孔板中，然后再加100μL无血清培养基，CO2培养箱中，37°C培养6h；弃上清，加入完全培养基继续培养过夜。

1.2.3 MTT法测定

设立空白对照组、脂质体组、miR-124模拟物组以及miR-124抑制剂组。每组设立4个重复孔，分别在转染24h、48h和72h后，每孔加入 MTT溶液（5mg／ml）20μL，继续孵育4h，终止培养，弃去培养液，每孔加入150μL二甲亚砜，震荡10min，选择570nm波长，在酶标仪上测定各孔的吸光度值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 miR-124模拟物对人成骨肉瘤MG-63细胞增殖活性的影响

人成骨肉瘤MG-63细胞经miR-124模拟物处理后，细胞生长明显比未处理细胞的生长减缓；处理24h、48h、72h后其吸光值 A值分别为（0.149±0.006）、（0.163±0.007）、（0.212±0.009），分别与对照组（0.261±0.017）、（0.379±0.021）、（0.414±0.031）相比，均显著下调，具有显著抑制作用，差异有统计学意义（P＜0.01），提示miR-124模拟物可抑制人成骨肉瘤MG-63细胞增殖活性。

2.2 miR-124抑制剂对人成骨肉瘤MG-63细胞增殖活性的影响

人成骨肉瘤MG-63细胞经miR-124抑制剂处理后，细胞生长明显比未处理细胞的生长迅速；处理24h、48h、72h后其吸光值 A值分别为（0.313±0.016）、（0.542±0.033）、（0.713±0.041），分别与对照组（0.261±0.017）、（0.379±0.021）、（0.414±0.031）相比，均显著上调，具有显著促进作用，差异有统计学意义（P＜0.01），提示miR-124抑制剂可促进人成骨肉瘤MG-63细胞增殖活性。

3 讨论

骨肉瘤又称成骨肉瘤，是恶性骨肿瘤中最常见恶性程度最高的一种，又分为成骨性骨肉瘤及溶骨性骨肉瘤两类。发病年龄多在15～25岁。70%以上的患者发生在股骨远端和胫骨近端。恶性肿瘤难以治愈的主要原因就是不容易早期诊断，一旦确诊，大多数已经到中晚期，已形成较广泛的浸润或转移，临床治疗效果差。成骨肉瘤肺转移是目前导致患者治疗失败和死亡的最主要的原因。

miRNA是新近证明的一类长约19～25nt的内源性非编码的小分子RNA，在多个物种中广泛存在，包括动物、植物和病毒。目前，被证实的小RNA就有500多种，而计算机预测可能会超过1000个，且约1／3的人类基因被小RNA调控。随着更多的miRNA被鉴定和深入研究，越来越多的证据表明，miRNA在细胞生长、增殖、发育和凋亡过程中扮演着重要角色，并与多种肿瘤的发生有关。目前，有研究利用针对目的miRNA进行模拟物过表达或者抑制剂干扰miRNA来研究各种miRNA在细胞中的生物学功能［6］。miR-124在多种肿瘤组织和细胞中表达下调［2-5］，本研究显示miR-124的模拟物及抑制剂分别可抑制和促进人成骨肉瘤MG-63细胞生长增殖活性，提示miR-124可能作为抑瘤基因miRNA参与成骨肉瘤的发生发展。

miRNA可以作为新的分子标志物用于恶性肿瘤的早期诊断和预后预测，将展示出广阔的临床应用前景。针对miR-124建立行之有效的检测手段以及靶向治疗策略，为进一步阐明成骨肉瘤发生发展的分子机制，将为成骨肉瘤早期诊断、治疗方案选择、疗效评价以及预后判断提供重要的理论和实验依据。综上所述，miR-124有调控骨肉瘤细胞的增殖能力，miRNA是一种天然的反义作用因子，利用miRNA模拟物或抑制剂可能成为基因治疗骨肉瘤的一个新的研究方向。但miR-124不是骨肉瘤中唯一异常表达的miRNA，因此应该找出更多异常表达的miRNA分子，发现它们之间的联系，为更好理解骨肉瘤的发生机制及骨肉瘤的基因治疗提供更好的理论支持。

［1］ZHANG L，DENG T，LI X，et al.microRNA-141is involved in a nasopharyngeal carcinoma-related genes network［J］.Carcinogenesis.2010，31（4）：559-66.

［2］FURUTA M，KOZAKI KI，TANAKA S，et al.miR-124and miR-203are epigenetically silenced tumor-suppressive microRNAs in hepatocellular carcinoma.Carcinogenesis［J］.2010，31（5）：766-76.

［3］LI KK，PANG JC，CHING AK，et al.miR-124is frequently down-regulated in medulloblastoma and is a negative regulator of SLC16A1［J］.Hum Pathol，2009，40（9）：1234-43.

［4］PIERSON J，HOSTAGER B，FAN R，et al.Regulation of cyclin dependent kinase 6by microRNA 124in medulloblastoma［J］.J Neurooncol，2008，90（1）：1-7.

［5］HUNT S，JONES AV，HINSLEY EE，et al.MicroRNA-124 suppresses oral squamous cell carcinoma motility by targeting ITGB1［J］.FEBS Lett，2011，585（1）：187-92.

［6］吴子晏，刘小云，杨述华，等.miR-21对骨肉瘤细胞增殖的影响［J］.中国癌症杂志，2010，20（8）：561-564.