淋病奈瑟菌gyr A和par C基因喹诺酮耐药决定区突变与环丙沙星耐药相关性研究

高家良 王黎芳 李洵璐 周娇萍 孙爱华

鉴于淋病奈瑟菌对青霉素和四环素高度耐药世界卫生组织于20世纪80年代提出将第三代头孢菌素及喹诺酮类药物推荐为治疗淋病的一线药物［1］。但随着喹诺酮类药物的大量和广泛的应用，临床对该类药物的敏感性逐渐下降出现耐药，我国淋病奈瑟菌耐药监测组连续20年对耐药率变化检测发现，淋病奈瑟菌临床菌株对环丙沙星的耐药率从1995年的15．48%增至 2000年的 85．20%，2005年为 94．3%，而 2008 年达到 96．13%［2～4］。

淋病奈瑟菌对喹诺酮类药物的耐药机制复杂，目前认为编码DNA螺旋酶A亚单位gyrA基因及拓扑异构酶ⅣC亚单位parC基因的喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance determining regions，QRDR)突变起了重要作用［5］。为探讨淋病奈瑟菌对喹诺酮类药物环丙沙星的耐药机制，我们收集了137株淋病奈瑟菌临床菌株并检测其对6种抗生素的耐药性，对50株环丙沙星耐药的临床菌株gyrA和parC基因QRDR区PCR扩增并直接测序，探讨gyrA和parC基因的QRDR突变与细菌耐药的相关性。

材料与方法

1．菌株的来源:2009年6月～2010年6月从浙江省宁波地区多家医院及计划生育指导站收集淋病奈瑟菌137株，已按常规细菌学分离及鉴定。青霉素、四环素、环丙沙星、氧氟沙星、头孢曲松和大观霉素购自Sigma公司，药敏质控及PCR阳性对照株淋病奈瑟菌ATCC49226和PCR阴性对照大肠杆菌标准株ATCC25922由浙江大学医学院病原生物系提供，采用琼脂稀释法测定各抗生素最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)［4］。配制含10%脱纤维羊血、抗生素浓度均分别为0．015～32mg/L(大观霉素为1．0～256mg/L三管)的GC琼脂平板，37℃孵育24h检菌。各淋病奈瑟菌临床菌株和质控菌株在GC培养基上传代2次后，用24h新鲜培养物制成107cfu/ml的菌悬液，接种于检菌合格的药敏平板，36℃培养48h后观察结果，以细菌生长被抑制的药物最高稀释度为MIC。对各抗生素耐药的判断标准如下:青霉素、四环素和氧氟沙星均为MIC≥2mg/L，头孢曲松为MIC≥0．5mg/L，大观霉素为MIC≥128mg/L，对环丙沙星≥4mg/L为高度耐药，MIC≥1mg/L为低度耐药，0．06mg/L ＜MIC≤0．5mg/L为中介，MIC≤0．06mg/L 为敏感［4］。

2．实验方法:(1)DNA模板的制备:采用申能博彩(Bio-Color)生物有限公司提供的DNA提纯试剂盒制备DNA模板，具体步骤如下:挑取5个菌落置于50μl DNA提取液中，混匀后沸水浴10min，取5μl作为PCR的DNA模板。(2)引物设计:参考GenBank登录淋病奈瑟菌gyrA和parC基因参考序列(Genbank accession no:U08817和U08907)及QRDR位置设计上、下游引物。gyrA基因上游引物序列:5'－CGG CGC GTA CTG TAC GCG －3'，下游引物序列:5'－CGA GCC GTT GAC GAG CAG －3'。parC基因上游引物序列:5'－AAG GCC GCG CGCTGCCTG －3'，下游引物序列:5'－ CGG ACA ACA GCA ATT CCG －3'。委托上海生工生物技术有限公司(Sangon)合成引物。(3)PCR扩增及扩增产物检测:PCR总体积为100μl，内含 2．5mol/L 各 dNTP、250nmol/L 各引物、2．5U Ex－Taq DNA聚合酶(TaKaRa)、5μl细菌DNA提取物为模板、1×PCR 缓冲液(pH8．3)。PCR 参数:94℃ 4 min;94℃30s，58℃ 30s，72℃ 30s，35 个循环;72℃ 5 min。采用 1μg/ml溴乙锭预染色的2．0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，目的基因扩增片段预期大小分别为378 bp和321bp，扩增产物包括gyrA和parC基因QRDR的区域。(4)核苷酸序列测定及分析:随机选取对环丙沙星耐药的淋病奈瑟临床菌株50株，采用BioColor公司的3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒提纯，委托Sangon公司测定50株淋病奈瑟菌PCR产物gyrA和parC基因片段的核苷酸序列。参照已报道的淋病奈瑟菌野生株gyrA和parC基因(Genbank accession no:U08817和U08907)QRDR核苷酸序列，对随机抽取的50株淋病奈瑟菌gyrA和parC基因QRDR核苷酸及推测的氨基酸序列进行比较，以确定上述菌株gyrA和parC基因QRDR的突变情况。

3．统计学方法:检测结果的分析和比较采用Stata 8．0统计学软件中的χ2检验，对检测结果进行比较，p＜0．05认为有差异。

结 果

1．PCR扩增结果:137株淋病奈瑟菌DNA都能用自行设计引物扩增出gyrA和parC基因目的片段，2．0%琼脂糖凝胶电泳显示gyrA和parC基因目的片段为预期大小(此处不显示)。同样条件下PCR扩增淋病奈瑟菌标准株ATCC49226 DNA结果为阳性，大肠杆菌标准株ATCC25922 DNA结果为阴性。

2．MICs检测结果:137株淋病奈瑟菌临床菌株对6种检测抗生素的MICs和耐药情况见表1。未发现对大观霉素和头孢曲松耐药菌株。对环丙沙星全部耐药，对其余3种抗生素青霉素、四环素和氧氟沙星的耐药率分别为 76．6%(105/137)、75．2%(103/137)和97．1%(133/137)。

3．gyrA和parC基因QRDR变异情况:137株淋病奈瑟菌临床菌株中随机抽取50株PCR扩增gyrA和parC基因，PCR产物纯化后测序。结果QRDR测序的50株淋病奈瑟菌临床菌株中13株只存在gyrA基因点突变，占26．0%，其余37株(74．0%)淋病奈瑟菌临床菌株除gyrA基因存在突变外同时伴有parC基因至少1个位点突变。在gyrA基因共检测到3种编码氨基酸的核苷酸序列发生错义突变，其中S91F突变发生在所有检测菌株，49株(98．0%)D95位发生突变，其中D95G、D95A、D95N和D95E突变分别有12、25、11和1株，1株(2．0%)不发生 D95突变而发生A92P突变。37株(74．0%)淋病奈瑟菌临床菌株有parC基因至少1个位点突变，且parC基因突变位点较多且相对比较分散，其中28株(28/35，75.7%)parC 基因 85、86、87、88 和 91 位发生单位点突变，包括G85C(1株)、D86N(7株)、S87R/N/I(23株)、S88P(1株)和 E91G/Q/K/A(7株);9株(9/37，24．3%)parC基因发生双重突变，包括S87R+E91A(7株)和S86N+S87I(2株)(表2)。

表1 137株淋病奈瑟菌临床分离株对6种抗生素的耐药率比较

表2 50株对环丙沙星耐药的淋病奈瑟菌临床菌株gyr A和par C QRDR变异情况

4．gyrA和parC基因与耐药的相关性:只存在gyrA基因突变的13株菌株，其中10株对环丙沙星呈低度耐药(10/13，76．9%)，3株对环丙沙星呈高度耐药(3/13，23．1%)。37株淋病奈瑟菌临床菌株除gyrA基因存在突变外伴有parC基因QRDR至少1个位点突变，其中9株对环丙沙星呈低度耐药(9/37，24．3%)，28株对环丙沙星呈高度耐药(28/37，75.7%)。gyrA基因突变不伴parC基因突变引起淋病奈瑟菌临床菌株对环丙沙星高度耐药占23．1%(3/13)，gyrA基因突变伴有parC基因突变引起淋病奈瑟菌临床菌株对环丙沙星高度耐药占75．7%(28/37)，两组间有统计学显著性差异(χ2=11．3，P ＜0.01)。28株淋病奈瑟菌临床菌株发生parC基因单个位点突变，其中9株(9/28，32．1%)对环丙沙星呈低度耐药，19株(19/28，67．9%)对环丙沙星呈高度耐药，发生parC基因两个位点突变的9株淋病奈瑟菌临床菌株药敏结果对环丙沙星全部呈高度耐药(9/9，100%)，parC基因单个位点突变与两个位点突变引起淋病奈瑟菌临床菌株对环丙沙星高度耐药有显着性差异(χ2=3．8，P ＜0．01)(表 2)。

讨 论

流行病学调查显示，20世纪80年代开始环丙沙星用于淋病的治疗，随着环丙沙星等喹诺酮类药物的广泛使用，90年代其敏感性开始下降，到了2000年前后，许多国家与地区环丙沙星耐药率已达90%以上［2～4］，笔者收集的137株淋病奈瑟菌临床菌株对6种抗生素的耐药试验表明，环丙沙星耐药率为100%，其他喹诺酮类药物如氧氟沙星的耐药率也达97．1%，说明喹诺酮类药物已不能成为本地区治疗淋病的药物。137株淋病奈瑟菌临床菌株未检测到对大观霉素和头孢曲松耐药，提示大观霉素和头孢曲松可作为淋病治疗的推荐药物。

淋病奈瑟菌对喹诺酮类药物耐药机制较为复杂，但最主要与编码DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ的基因的突变有关，国外研究已发现，gyrA和parC基因突变位点集中发生在核苷酸序列N端199～318的区间内，即所谓喹诺酮耐药决定区(QRDR)，淋病奈瑟菌对喹诺酮类药物耐药性的发生与gyrA和parC基因QRDR突变有关［4］。其中gyrA基因参与编码的DNA旋转酶是喹诺酮类药物的主要作用靶位，Deguchi等研究发现对喹诺酮类敏感的淋病奈瑟菌gyrA基因没有突变，耐药株一般都有gyrA基因突变，其中编码91位丝氨酸(S91)和95位天冬天氨酸(D95)的密码子最易发生突变［6，7］，我们对 50株耐环丙沙星的淋病奈瑟菌临床菌株的测序结果发现S91F突变发生在所有检测菌株，49株(49/50，98．0%)淋病奈瑟菌临床菌株G/A/N/E突变，其中1株发生D95E突变未见文献报道，1株D95不发生突变而发生A92P突变，表明gyrA基因发生点突变特别S91和D95突变是造成淋病奈瑟球菌临床菌株产生喹诺酮类耐药的主要原因。Deguchi等也发现对喹诺酮类耐药的淋病奈瑟菌临床菌株parC基因存在86、87、88和91的突变，而药物敏感株没有这些突变，另有研究发现，parC基因突变基因仅出现在已存在gyrA基因双突变且高度耐药的菌株中［6，7］，提示parC基因突变可能与淋病奈瑟菌对喹诺酮类药物耐药程度相关。我们检测了50株淋病奈瑟菌临床菌株parC的QRDR核苷酸序列，37株淋病奈瑟菌临床菌株除gyrA基因存在突变同时伴有parC基因QRDR至少1个位点突变引起高度耐药28株占75．7%，13株gyrA基因突变不伴parC基因突变引起高度耐药3株占23．1%，两组间有统计学显著性差异(χ2=11.3，p＜0.01)，说明是否伴随parC基因突变与淋病奈瑟菌临床菌株对环丙沙星高度耐药明显相关。28株淋病奈瑟菌临床菌株发生parC基因单位点突变中19株对环丙沙星呈高度耐药占67．9%，所有发生parC基因双位点突变的9株淋病奈瑟菌临床菌株对环丙沙星全部呈高度耐药，有显著性差异(χ2=3．8，P ＜0．01)。说明 parC 基因突变位点数目与淋病奈瑟菌临床菌株对环丙沙星耐药程度明显相关性，这与国外文献报道相似［2～4，7］。

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2 Furuya R，Tanaka M．Neisseria gonorrhoeae infections［J］．Nippon Rinsho，2009，67(1):129 －135

3 Yang Y，Liao MM，Gu WM，et al．Antimicrobial susceptibility and molecular determinants of quinolone resistance in N．gonorrhoeae isolates from Shanghai［J］．J Antimicrobial Chemotherapy，2006，58(4):868－872

4 Zhang TJ，Zhou XM，Zhang JL，et al．Fluoroquinolone resistance among Neisseria gonorrhoeae isolates from Shanghai，China:detection of quinolone resistancedetermining region mutations［J］．Indian J Med Res，2009，129(6):701－706

5 Clinical and Laboratory Standards Institute．Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically:approved standard［M］．7th ed．2006:M7 － A7

6 Deguchi T，Yasuda M，Nakano M，et al．Quinolone－resistant Neisseria gonorrhoeae:correlation of alterations in the GyrA subunit of DNA gyrase and the ParC subunit of topoisomerase IV with antimicrobial susceptibility profiles［J］．Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1996，40(4):1020－1023

7 Pérez－Losada M，Crandall KA，Bash MC，et al．Distinguishing importation from diversification of quinolone－resistant Neisseria gonorrhoeae by molecular evolutionary analysis［J］．BMCEvol Biol，2007，7(1):84－93